人高遷移率族蛋白1的克隆、表達(dá)及其功能研究.pdf

1、研究的目的和意義膿毒癥(sepsis)指由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemicinflammatoryresponsesyndrome，SIRS)，是各種嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷、缺氧、再灌注損傷及外科大手術(shù)后常見的并發(fā)癥，進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征(multipleorgandysfunctionsyndrome，MODS)，是當(dāng)前創(chuàng)傷外科面臨的棘手難題，已成為臨床危重患者的重要死因之一。近十年來，隨著炎癥反應(yīng)機(jī)

2、制研究的不斷深入，人們對于膿毒癥的本質(zhì)與病理過程有了進(jìn)一步的理解，即認(rèn)識到膿毒癥、嚴(yán)重膿毒癥、膿毒性休克及MODS是反映體內(nèi)一系列病理生理改變及臨床病情嚴(yán)重程度變化的動態(tài)過程，實(shí)質(zhì)是機(jī)體全身炎癥反應(yīng)不斷加劇、持續(xù)惡化的結(jié)果。嚴(yán)重創(chuàng)傷可以誘發(fā)初期的炎癥反應(yīng)，但由于機(jī)體產(chǎn)生的多種炎癥介質(zhì)所形成的級聯(lián)效應(yīng)，可使炎癥反應(yīng)擴(kuò)大甚至失去控制，最終導(dǎo)致以細(xì)胞自身性破壞為特征的全身性炎癥反應(yīng)。過去普遍認(rèn)為“早期”炎癥介質(zhì)如TNF-a和IL-1是引起多器

3、官損害和死亡的“核心因子”，然而TNF-a和IL-1受體拮抗劑的臨床應(yīng)用并未取得明顯效果。膿毒癥后期，雖然患者病情持續(xù)加重直至死亡，但是TNF-a和IL-1水平往往已恢復(fù)至正常。這提示人們，可能存在某些晚期炎癥介質(zhì)參與了膿毒癥后期的病理生理過程。 1999年，Wang等首次報道高遷移率族蛋白1(highmobilitygroupbox-1protein，HMGB-1)作為新的潛在的晚期炎癥介質(zhì)參與了膿毒癥的發(fā)病過程，是內(nèi)毒素致死

4、效應(yīng)的晚期重要炎癥介質(zhì)。此后，有關(guān)HMGB1與膿毒癥的關(guān)系日益成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。越來越多的文獻(xiàn)報道，在各種急性炎癥條件下，HMGB1可在細(xì)胞外或胞漿的表達(dá)。在對小鼠內(nèi)毒素血癥的研究中發(fā)現(xiàn)，LPS激發(fā)16-32h后血清HMGB1水平顯著升高，且給小鼠全身注射rHMGB1可致死。體外研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、MIP-1α、MIP-1β；用全長HMGB1

5、分子或HMGB1的B盒片段刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞可上調(diào)ICAM-1、VCAM-1、E-選擇素等粘附分子，并促進(jìn)IL-8、G-CSF釋放，且呈劑量關(guān)系。 目前，有關(guān)HMGB1作為膿毒癥新的“晚期”介質(zhì)研究尚處于探索階段，許多重要問題亟待研究。例如，HMGB1是否確實(shí)參與了全身炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展過程?HMG21介導(dǎo)炎癥細(xì)胞活化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程是什么?其改變與嚴(yán)重創(chuàng)傷后膿毒癥的本質(zhì)聯(lián)系及臨床意義如何?針對HMGB1這一潛在“晚期”介質(zhì)進(jìn)

6、行干預(yù)是否有助于膿毒癥及MODS的防治?這些問題的解決可望為膿毒癥和MODS的發(fā)病機(jī)制提供新的理論解釋，并為其防治開辟新的途徑。 基于上述研究背景，本課題擬通過重組HMGB1，觀察其對參與炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞——內(nèi)皮細(xì)胞釋放細(xì)胞因子的影響；了解HMGB1能否協(xié)同LPS刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放炎性細(xì)胞因子?為進(jìn)一步探討HMGB1病理生理作用及其調(diào)控機(jī)制打下基礎(chǔ)。 研究方法1.HMGB1基因的克?。和ㄟ^聚合酶鏈反應(yīng)(polymeras

7、echainreaction，PCR)擴(kuò)增出HMGB1的編碼基因，克隆到載體pET14bMCS，通過PCR、酶切和測序鑒定克隆的正確性。 2.HMGB1蛋白的原核表達(dá)及純化：將陽性克隆轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)His-HMGB1融合蛋白，使用Ni-NTA親和樹脂純化。將純化得到的HMGB1蛋白經(jīng)透析過濾除菌后-20℃保存。 3.用不同劑量(終濃度分別為3μg/ml、15μg/ml、75μg/ml)重

8、組HMGB1刺激HUVEC，24h后收集培養(yǎng)上清，經(jīng)LiquiChip液相蛋白芯片系統(tǒng)檢測GMCSF、IFN-γ、IL-10、IL-12、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、TNF-a、MCP-1等11種細(xì)胞因子的水平。 4.用不同劑量(終濃度分別為3μg/ml、15μg/ml、75μg/ml)重組HMGB1刺激HUVEC，24h后收集培養(yǎng)上清；或在HMGB1(15μg/ml)刺激HUVEC后不同時間點(diǎn)收集培養(yǎng)上

9、清，經(jīng)LiquiChip液相蛋白芯片系統(tǒng)檢測細(xì)胞因子IL-6、IL-8以及MCP-1的水平。 5.用不同劑量(終濃度分別為3μg/ml、15μg/ml、75μg/ml)重組HMGB1與LPS(10ng/ml)共刺激HUVEC，24h后收集培養(yǎng)上清，經(jīng)LiquiChip液相蛋白芯片系統(tǒng)檢測細(xì)胞因子IL-6、IL-8以及MCP-1的水平。 結(jié)果1.克隆的His-taggedHMGB1表達(dá)載體經(jīng)酶切和測序驗(yàn)證正確，并用Ni-N

10、TA親和層析法純化得到了His-HMGB1融合蛋白。 2.用不同劑量的HMGB1蛋白分別刺激HUVEC，發(fā)現(xiàn)只有IL-6、IL-8和MCP-1三種細(xì)胞因子隨著HMGB1蛋白刺激劑量的增加，釋放亦隨之遞增。 3.用不同劑量的HMGB1蛋白分別刺激HUVEC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著蛋白刺激劑量的增加，IL-6、IL-8和MCP-1的釋放亦隨之遞增，HMGB1蛋白刺激組與對照組之間的差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4.用HMGB1蛋白刺

11、激HUVEC1h、3h、6h、12h、24h后，IL-6、IL-8和MCP-1的水平隨著刺激時間的延長，分泌量呈遞增趨勢。 5.通過HMGB1蛋白與LPS共同誘導(dǎo)細(xì)胞因子生成的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在重組HMGB1蛋白刺激劑量為75μg/ml時，對LPS誘導(dǎo)細(xì)胞因子IL-6、IL-8生成的效應(yīng)最強(qiáng)；在HMGB1蛋白刺激劑量為15μg/ml時，對LPS誘導(dǎo)趨化因子MCP-1生成的效應(yīng)最強(qiáng)。 結(jié)論1.成功克隆、表達(dá)和純化了His-HMG

12、B1蛋白，為進(jìn)一步研究HMGB1蛋白的生物學(xué)功能提供了實(shí)驗(yàn)材料。 2.HMGB1蛋白刺激HUVEC，可引起IL-6、IL-8和MCP-1的上調(diào)，并且具有時效性和量效性關(guān)系。提示HMGB1作為炎癥介質(zhì)可刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放炎性細(xì)胞因子。 3.HMGB1蛋白可顯著增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的生成，提示HMGB1可能通過LPS非依賴途徑誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的釋放。 上述研究結(jié)果為進(jìn)一步探討HMGB1病理生理作用及其調(diào)控機(jī)制打下