人高遷移率族蛋白B1及其多克隆抗體的制備與鑒定.pdf

1、研究背景和目的：高遷移率族蛋白B1(highmobilitygroupbox-1，HMGB1)曾稱為HMG1，是30多年前發(fā)現(xiàn)非組蛋白核蛋白，因其在凝膠電泳中泳動(dòng)速度快而得名[1]。在細(xì)胞核內(nèi)，HMGB1作為核功能調(diào)節(jié)性輔助因子，參與基因轉(zhuǎn)錄、DNA復(fù)制、修復(fù)及V-(D)-J重排等重大生命活動(dòng)調(diào)控過(guò)程[2]。在細(xì)胞膜表面，HMGB1作為生長(zhǎng)因子，與晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptorforadvancedglycationend-p

2、roducts，RAGE)結(jié)合介導(dǎo)神經(jīng)軸突生長(zhǎng)，與機(jī)體中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、成熟有關(guān)[3]。在胞外，HMGB1作為細(xì)胞因子，具有多種生物學(xué)與病理學(xué)作用：介導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞[4]、中性粒細(xì)胞[5]、內(nèi)皮細(xì)胞[6]釋放多種炎癥因子如TNF、IL-1α、IL-1β等，與多種急慢性炎癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)；作為平滑肌細(xì)胞的強(qiáng)趨化劑，HMGB1可促使平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜轉(zhuǎn)移，在動(dòng)脈粥樣硬化和動(dòng)脈損傷后再狹窄的病理過(guò)程中發(fā)揮作用[7]；HMGB1可抑制腫瘤細(xì)胞

3、凋亡[8]、促進(jìn)纖維蛋白酶原活化而有利于腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移入侵時(shí)基質(zhì)溶解[9];通過(guò)增加CD40、CD54、CD58、CD80和CD83的表達(dá)而使樹突狀細(xì)胞表型成熟，具有免疫增強(qiáng)效應(yīng)[10,11]；HMGB1可誘導(dǎo)成年和胚胎血管相關(guān)干細(xì)胞遷移與增殖，參與組織再生[12]。目前，我們對(duì)HMGB1的了解仍很膚淺，許多問(wèn)題亟待解決，如HMGB1生物學(xué)合成的調(diào)節(jié)與釋放的確切機(jī)制是什么?細(xì)胞膜表面HMGB1不誘導(dǎo)炎癥而僅促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)?HMGB1靶向性

4、抗炎治療是否會(huì)妨礙神經(jīng)軸突生長(zhǎng)及基礎(chǔ)修復(fù)機(jī)制?以及HMGB1在疾病如膿毒癥、腫瘤等發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中的作用與臨床意義?隨著研究的深入，這些問(wèn)題將得到解決。本研究中，我們制備具有功能活性的人HMGB1，并以此為免疫原免疫兔，獲得兔抗人HMGB1多克隆抗體，旨在為深入探討人HMGB1的生物學(xué)特點(diǎn)及其與相關(guān)疾病的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.人HMGB1cDNA的克隆自人扁桃體組織提取細(xì)胞總RNA，以RT-PCR法擴(kuò)增人HMGB

5、1cDNA片段，將此片段連接于pUC19質(zhì)粒后送上海生工公司測(cè)序。 2.重組原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建將人HMGB1cDNA片段插入原核表達(dá)載體pQE-80L，然后行酶切鑒定。將所構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pQE-80L/HMGB1。 3.目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定將構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pQE-80L/HMGB1轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α并以IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，用SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況，再以Westernblot進(jìn)行鑒定，

6、最后對(duì)重組蛋白的IPTG誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化選擇。 4.目的蛋白的分離純化收集并超聲破碎經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的細(xì)菌，離心后，分別取細(xì)菌裂解液上清和沉淀行SDS-PAGE，以鑒定目的蛋白的表達(dá)形式。將細(xì)菌裂解液上清過(guò)Ni2+-NTA柱純化目的蛋白后，再過(guò)多粘菌素B柱以去除目的蛋白中混雜的LPS。 5.目的蛋白生物學(xué)活性的檢測(cè)將純化的重組人HMGB1加入人外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)體系，以ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中TNF-

7、α與IL-6含量。 6.兔抗人HMGB1多克隆抗體的制備以純化的人HMGB1為免疫原免疫兔，ELISA法檢測(cè)抗血清效價(jià)，Westernblot法鑒定抗體特異性。 7.Westernblot法檢測(cè)膿毒癥患者血清中的HMGB1。 8.分析抗體對(duì)HMGB1生物學(xué)活性的拮抗效應(yīng)分別將HMGB1、HMGB1+抗血清、HMGB1+免疫前兔血清加入人外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)體系，作用4h后收集培養(yǎng)上清，以ELISA法檢測(cè)TNF-α、

8、IL-6含量。 結(jié)果： 1.經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增人HMGB1cDNA，得到了長(zhǎng)度為648bp的目的片段，經(jīng)序列比對(duì)，與GenBank中報(bào)道的已知序列完全一致。 2.重組表達(dá)質(zhì)粒pQE-80L/HMGB1經(jīng)HindⅢ+KpnⅠ雙酶切后，可見(jiàn)大小約為648bp的目的片段。表明重組原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。 3.經(jīng)對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化，確定了最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為終濃度0.5mmol/L的IPTG，在37℃誘導(dǎo)表達(dá)4h。

9、SDS-PAGE分析可見(jiàn)，表達(dá)的目的蛋白分子量約為30kDa，主要以分泌形式存在。經(jīng)Westernblot證實(shí)，在大小約為30kDa的位置有清楚的單一蛋白條帶。 4.目的蛋白經(jīng)Ni2+-NTA柱純化后，再經(jīng)多粘菌素B柱有效地去除了LPS，純化的蛋白在SDS-PAGE上呈現(xiàn)單一條帶，證明目的蛋白得到有效的純化。 5.生物學(xué)活性的初步分析顯示，重組人HMGB1可有效刺激人外周血單核細(xì)胞分泌致炎因子TNF-α、IL-6,與對(duì)照

10、組相比，p＜0.05,具有顯著性差異。 6.用ELISA法測(cè)定末次免疫后抗血清的效價(jià)為1∶25600。以制備的兔抗人HMGB1多克隆抗體為一抗行Westernblot檢測(cè)，結(jié)果顯示對(duì)應(yīng)于E.coliDH5α誘導(dǎo)表達(dá)的人HMGB1蛋白位置(30kDa)上有單一陽(yáng)性條帶，同時(shí)對(duì)膿毒癥患者血清的Westernblot檢測(cè)亦顯示在相同位置有單一反應(yīng)條帶，而抗體與細(xì)菌其它成分及正常人血清無(wú)明顯反應(yīng)。 7.與HMGB1刺激組相比，H

11、MGB1+抗血清與人外周血單核細(xì)胞作用后，炎癥因子TNF-α、IL-6分泌水平明顯下降(P＜0.01)，而HMGB1+免疫前兔血清與人外周血單核細(xì)胞作用后，TNF-α、IL-6的分泌水平無(wú)明顯下降(P＞0.05)，表明HMGB1抗體能有效抑制HMGB1的致炎活性。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)利用RT-PCR方法擴(kuò)增了編碼人HMGB1氨基酸序列的cDNA，成功構(gòu)建了重組原核表達(dá)質(zhì)粒pQE-80L/HMGB1。將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，成功地