人高遷移率族蛋白突變體的制備及其功能的初步研究.pdf

1、嚴(yán)重?zé)齻?、?chuàng)傷可以誘發(fā)機(jī)體初期的炎癥反應(yīng)，但由于機(jī)體產(chǎn)生的多種炎癥介質(zhì)形成的瀑布效應(yīng)，可以使炎癥反應(yīng)擴(kuò)大甚至失去控制，最終導(dǎo)致以細(xì)胞自身性破壞為特征的全身性炎癥反應(yīng)。膿毒癥是由機(jī)體過度炎癥反應(yīng)或炎癥失控所致。膿毒癥、膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征是反映機(jī)體內(nèi)一系列病理生理改變及臨床病情嚴(yán)重程度變化的動態(tài)過程，實(shí)質(zhì)是全身炎癥反應(yīng)綜合征不斷加劇、持續(xù)惡化的結(jié)果。糖皮質(zhì)激素、抗內(nèi)毒素抗體、腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Fact

2、or，TNF)拮抗劑，白介素-1(Interleukin-1β，IL-1)受體拮抗劑等被認(rèn)為能阻斷這種炎癥“連鎖反應(yīng)”。但多項(xiàng)臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)，抗炎癥治療并沒有達(dá)到預(yù)期效果。其原因在于大多數(shù)致炎因子在發(fā)生炎癥反應(yīng)的6個小時(shí)內(nèi)即已經(jīng)釋放并達(dá)高峰(這些致炎因子被稱為早期炎癥因子、如TNF、IL-1、IL-6等)，故針對這些早期炎癥因子的臨床治療窗口期相當(dāng)窄，稍一延遲其治療效果就會大大降低，甚至根本無效。于是，研究者們致力于尋找晚期致炎因子。19

3、99年，Wang等首次報(bào)道高遷移率族蛋白(high mobility group box-1protein，HMGB1)可能作為一種晚期炎癥介質(zhì)參與了膿毒癥的發(fā)病過程。HMGB1是一種在真核細(xì)胞中廣泛表達(dá)并且高度保守的蛋白。它首先是作為一種DNA結(jié)合蛋白而被發(fā)現(xiàn)的，對正常轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和基因表達(dá)起重要作用的結(jié)構(gòu)因子。研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1能被激活的免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞)釋放到細(xì)胞外，作為潛在的致炎因子，介導(dǎo)膿毒癥的發(fā)生，而且更有意義的

4、是HMGB1是一種重要的全身炎癥反應(yīng)晚期炎癥介質(zhì)。這提示了HMGB1的治療窗口期比其它早期炎癥因子更寬，相對于腫瘤壞死因子(TNF)在受到刺激后數(shù)分鐘就產(chǎn)生了，其循環(huán)濃度在疾病進(jìn)展的頭幾個小時(shí)就達(dá)到基礎(chǔ)水平，HMGB1在受到刺激后大約20小時(shí)后才由巨噬細(xì)胞分泌。因此其治療窗口期更寬，使得該分子成為防治全身性炎癥及膿毒癥的措施中極具吸引力一個重要靶標(biāo)。 目前針對HMGB1的抗炎制劑主要有兩種，抗HMGB1抗體和乙基丙酮酸鹽。然而抗

5、HMGB1抗體在用于人體時(shí)，需使用人源化抗體，否則將會導(dǎo)致人抗異源性抗體反應(yīng)，甚至過敏反應(yīng)；乙基丙酮酸鹽抑制HMGB1釋放的具體機(jī)制尚不清楚，且其大量靜脈應(yīng)用時(shí)的毒性反應(yīng)還需探討。由此可見，上述兩類HMGB1抑制劑都還有很多不足之處，因此，除了對這兩類抑制劑進(jìn)行完善外，還需發(fā)展新型HMGB1抑制劑。基于以上分析，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了人HMGB1的六個突變體，成功制備并純化了HMGB1蛋白及其六個重組HMGB1突變體蛋白，根據(jù)各突變體蛋白與受體結(jié)

6、合情況及其致炎效應(yīng)，篩選出只與受體結(jié)合而不能誘發(fā)炎癥反應(yīng)的突變體并檢測其對HMGB1炎癥效應(yīng)的競爭性抑制作用。本研究旨在制備并尋找能競爭性抑制HMGB1致炎效應(yīng)的突變體，為進(jìn)一步研究和開發(fā)新型抗炎治療候選制劑奠定基礎(chǔ)。 目的： 構(gòu)建HMGB1的六個突變體，從中篩選出能與靶細(xì)胞膜上受體結(jié)合但沒有致炎效應(yīng)的突變體蛋白，并檢測其在體外競爭性抑制HMGB1致炎效應(yīng)的作用。 材料與方法： 1、人HMGB1的克隆取人

7、新鮮扁桃體組織，按Tripure試劑說明提取總RNA，根據(jù)GenBank中編碼人HMGB1的cDNA序列，設(shè)計(jì)一對特異性引物。按試劑盒說明進(jìn)行RT-PCR。純化回收RT-PCR產(chǎn)物。將RT-PCR產(chǎn)物連接于pUC18質(zhì)粒，重組質(zhì)粒命名為pUC18/HMGB1，然后由上海生工公司進(jìn)行序列測定。 2、人HMGB1突變體的構(gòu)建根據(jù)突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)六對引物，以重組質(zhì)粒pUC18/HMGB1為模板，一步反向PCR致突變法構(gòu)建人HMGB1突變體

8、，重組質(zhì)粒分別命名為：pUC18/HMGB1 M1，pUC18/HMGB1 M2，pUC18/HMGB1 M3，pUC18/HMGB1 M4，pUC18/HMGB1 M5，pUC18/HMGB1 M6。然后由上海英駿公司進(jìn)行序列測定。 3、表達(dá)載體的構(gòu)建酶切質(zhì)粒pUC18/HMGB1、pUC18/HMGB1 M1、pUC18/HMGB1 M2、pUC18/HMGB1 M3、pUC18/HMGB1 M4、pUC18/HMGB1 M

9、5、pUC18/HMGB1 M6，回收目的片斷并連接于原核表達(dá)載體pQE-80L。經(jīng)酶切鑒定得到重組原核表達(dá)載體，分別命名為：pQE-80L/HMGB1、pQE-80L/HMGB1 M1、pQE-80L/HMGB1 M2、pQE-80L/HMGB1 M3、pQE-80L/HMGB1 M4、pQE-80L/HMGB1M5、pQE-80L/HMGB1 M6。 4、目的蛋白表達(dá)、鑒定將構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，IPTG誘

10、導(dǎo)蛋白表達(dá)，并行SDS-PAGE檢測目的蛋白表達(dá)情況。再經(jīng)蛋白質(zhì)免疫印跡(WesternBlotting)鑒定表達(dá)的目的蛋白。 5、目的蛋白的分離純化收集經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的細(xì)菌，將超聲碎菌離心后的上清過Ni2+-NTA柱純化目的蛋白。 6、激光共聚焦將THP-1細(xì)胞作為HMGB1的靶細(xì)胞，取生長至對數(shù)生長期的THP-1細(xì)胞適量分別與純化的M1-M6六種突變體蛋白孵育一定時(shí)間，同時(shí)加入多粘菌素B排除LPS干擾，設(shè)陽性對照(

11、HMGB1蛋白)和陰性對照(PBS)。固定、封閉后依次分別加入一抗稀釋液(羊抗人HMGB1一抗)、FITC標(biāo)記二抗稀釋液(FITC標(biāo)記兔抗羊抗體)，置激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞膜上熒光。 7、IL-1β ELISA實(shí)驗(yàn)將生長至對數(shù)生長期的適量THP-1細(xì)胞共分為8個組：1-6組中分別加入M1-M6六種蛋白，7組為陽性對照(HMGB1蛋白)，8組作為陰性對照(PBS)。每組分別于2h、4h、6h、8h四個時(shí)相點(diǎn)收集加入不同蛋白的T

12、HP-1細(xì)胞懸液上清，按IL-1β ELISA試劑盒說明書行ELISA。 8、競爭性抑制實(shí)驗(yàn)將生長至對數(shù)生長期的適量THP-1細(xì)胞分組。除陰性對照組(PBS)，其余各組均加入HMGB1蛋白。再分別加入由IL-1β ELISA實(shí)驗(yàn)篩選得到的只與受體結(jié)合而不誘導(dǎo)炎癥因子釋放的突變體蛋白，即HMGB1 M1、M2、M3、M5、M6。分別于2h、4h、6h、8h四個時(shí)相點(diǎn)收集各孔中細(xì)胞懸液上清，按IL-1β ELISA試劑盒說明書行EL

13、ISA。將篩選出的競爭性抑制作用較強(qiáng)的突變體M1、M2分別行競爭性抑制實(shí)驗(yàn)，收集的樣本行TNF-α ELISA實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證IL-1β的結(jié)果。 結(jié)果： 1、經(jīng)RT-PCR成功克隆了編碼人HMGB1氨基酸的cDNA，片斷長為648bp。經(jīng)序列比對，與GenBank中報(bào)道的已知序列完全一致。 2、以獲得的pUC19/HMGB1為模板，經(jīng)一步反向PCR法成功構(gòu)建了HMGB1的六個突變體。經(jīng)序列測定，與預(yù)期設(shè)計(jì)相符。

14、 3、重組表達(dá)質(zhì)粒pQE-80L/HMGB1、pQE-80L/HMGB1 M1、pQE-80L/HMGB1 M2、pQE-80L/HMGB1 M3、pQE-80L/HMGB1 M4、pQE-80L/HMGB1 M5、pQE-80L/HMGB1M6經(jīng)酶切后可見648bp大小片斷，酶切結(jié)果表明表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。 4、經(jīng)IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)后，SDS-PAGE分析可見，目的蛋白大小約為30kDa。經(jīng)Western Blotting證實(shí)

15、，在30kDa處有明顯蛋白條帶。 5、目的蛋白經(jīng)Ni<'2+>-NTA柱純化后，純化的蛋白在SDS-PAGE上30kDa處呈現(xiàn)一條帶，證明該目的蛋白得到有效純化。 6、激光共聚焦實(shí)驗(yàn)顯示與陰性對照組相比，分別加入M1-M6六個突變體蛋白的THP-1細(xì)胞膜上均可見明顯綠色熒光。說明六種突變體蛋白均能與靶細(xì)胞THP-1細(xì)胞膜上受體結(jié)合。 7、IL-1β ELISA實(shí)驗(yàn)表明六個突變體中，M4組細(xì)胞上清中IL-1β含量顯

16、著高于陽性對照組，其余突變體都在某些時(shí)相點(diǎn)都低于陽性對照組，因此排除突變體M4。 8、競爭性抑制實(shí)驗(yàn)提示加入HMGB1 M6組在各時(shí)相點(diǎn)，其細(xì)胞上清中IL-1β含量都明顯高于陽性對照組(HMGB1)；其余各突變體HMGB1 M1、HMGB1 M2、HMGB1M3、HMGB1 M5在2h-6h細(xì)胞上清中IL-1β含量與陽性對照組沒有明顯差異(P>0.05)，但在6h-8h均能有效抑制HMGB1誘導(dǎo)IL-1β的表達(dá)。其中M2競爭性抑

17、制作用最強(qiáng)，在6h和8h均明顯低于陽性對照組(P<0.05)。將篩選出的競爭性抑制作用較強(qiáng)的M1、M2兩個突變體分別行競爭性抑制實(shí)驗(yàn)后，TNF-αELISA實(shí)驗(yàn)提示，加入M1、M2的兩組TNF-α的含量在各時(shí)相點(diǎn)都低于陽性對照，其中M1在8h時(shí)THP-1細(xì)胞上清中TNF-α的量顯著低于陽性對照組(P<0.05)，M2在6h-8h細(xì)胞上清中TNF-α的量顯著低于陽性對照組(P<0.05)。 結(jié)論： 本實(shí)驗(yàn)在成功制備、純化H

18、MGB1蛋白及其六個重組HMGB1突變體蛋白的基礎(chǔ)上，通過細(xì)胞免疫熒光標(biāo)記的方法，激光共聚焦顯微鏡篩選出能與THP-1細(xì)胞膜上受體結(jié)合的突變體，即HMGB1 M1-M6。通過ELISA篩選出能與受體結(jié)合卻沒有致炎效應(yīng)的突變體，即HMGB1 M1、M2、M3、M5、M6。競爭性抑制實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步篩選出能在體外有效競爭性抑制HMGB1致炎效應(yīng)的突變體，即HMGB1 M1、M2、M3、M5，并得到競爭性抑制作用最強(qiáng)的突變體HMGB1。M2。有望為