miRNA-30c在胃癌中的作用機制及臨床應用價值.pdf

1、目的：
　　檢測miR-30c在胃癌組織和胃癌細胞中的表達水平，進行體外功能試驗，確定下游靶標，探討miR-30c異常表達與胃癌發(fā)生的相關性并揭示相關分子機制。
　　方法：
　?。?）閱讀文獻結合前期實驗室獲得的miRNA芯片表達數(shù)據(jù)，預測miR-30c調節(jié)的靶基因。
　?。?）采用Real-time PCR技術驗證82對胃癌組織與癌旁遠端組織樣本中miR-30c、myc和PPARδ表達差異。
　　（3）體

2、外培養(yǎng)分化不同的2株胃癌細胞，以獲得永生化而無致癌性的人胃黏膜上皮細胞為對照。對體外培養(yǎng)的生長增殖期細胞進行轉染，采用miR-30c-mimic、miR-30c-inhibitor和Negtive Control（NC）調控胃癌細胞中miR-30c的表達，瞬時轉染后進行MTT法檢測細胞增殖能力，利用流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡情況，qRT-PCR、WesternBlot檢測miR-30c靶蛋白BCL-9及下游基因Myc和PPARδ的表達

3、情況。
　?。?）常規(guī)進行組織標本包埋、切片、系列脫蠟后采用免疫組化技術研究胃癌組織中BCL-9和GJA1的表達情況，并分析預測靶基因BCL-9和GJA1的差異表達與患者臨床資料的相關性。
　　結果：
　?。?）從前期胃癌miRNAs表達譜微陣列芯片篩選出一系列表達升高或降低的miRNAs，其中下調最顯著為miR-30c，下調8.36倍（P<0.05）。采用Real-time PCR技術擴大樣本進行驗證，我們發(fā)現(xiàn)在82

4、對胃癌組織與癌旁遠端組織配對樣本中，miR-30c在胃癌組織中呈低表達（P<0.05）,其表達趨勢與芯片結果一致。且miR-30c表達下調水平與患者年齡相關（P<0.05）。
　　（2）轉染miR-30c-mimic后細胞的增殖能力顯著降低，MKN-45在轉染后72h抑制率最高為18％，但與NC組比較在24h、48h、72h組間沒有差異（P>0.05）。MKN-74轉染后72h抑制率最高為17%，且較NC組24h與48和72小時有

5、差異（P<0.05）。GES-1則在轉染后48h達到最高抑制率26%，在48h與24和72小時與NC組相比較抑制率存在差異（P<0.05）。但是,轉染miR-30c-inhibitor后，細胞的增殖能力則增強，MKN-45在轉染24h后細胞增殖提高18%，與NC組比較24h與48和72小時組間比較存在差異（P<0.05）。MKN-74在轉染后48h達到30%，在24h、48h、72h時與NC組比較組間存在差異（P<0.05）。GES-1

6、則在轉染后72h時細胞增殖能力增強12%，且24h、48h、72h時與NC組比較組間存在差異（P<0.05）。
　?。?）miRNA-30c-mimic轉染三株細胞48h后，MKN-74細胞凋亡率則較NC組降低（P<0.05），而在GES-1細胞系中miRNA-30c-mimic組較NC組凋亡率升高（P<0.05）。轉染miRNA-30c-inhibitor48h后，MKN-45凋亡比率較NC組升高（P<0.05），MKN-74細

7、胞凋亡率則較NC組降低（P<0.05），進一步比較可以發(fā)現(xiàn)，在MKN74和GES-1細胞系中轉染miRNA-30c-mimic較miRNA-30c-inhibitor組細胞凋亡率明顯升高（P<0.05），即miRNA-30c-mimic促進凋亡，miRNA-30c-inhibitor則可以抑制凋亡，而在MKN45中則反之，
　?。?）在MKN45細胞系中，轉染miR-30c-mimic后較NC組G0/G1期細胞數(shù)量增加（ P<0.

8、05），而在MKN74和GES1細胞系中，轉染miR-30c-inhibitor后較NC組G0/G1期細胞數(shù)量增加（P<0.05）。
　　（5）Real-time PCR檢測顯示胃癌及癌旁組織中PPARδ和Myc在癌組織中表達降低，但與癌旁組織比較差異無顯著性（P>0.05）。進行細胞轉染后，我們發(fā)現(xiàn)，除GES-1細胞外，myc基因和PPARδ基因的表達同之前胃癌組織與癌旁組織的表達一致，即miR-30c高表達則下游myc基因和P

9、PARδ基因也呈現(xiàn)高表達，反之則低表達。
　?。?）Western Blot檢測顯示，在MKN-74細胞系中轉染miR-30c-mimic后較NC組（陰性對照組）BCL-9表達升高，轉染miRNA-30c-inhibitor后BCL9的表達較NC組降低；而在永生化的GES-1細胞系中，轉染miR-30c-mimic后，BCL-9表達較NC組均有所降低，但轉染miR-30c-inhibitor后，BCL-9表達增高較NC組明顯升高。

10、
　?。?）免疫組化檢測結果顯示，胃癌組織中BCL-9、GJA1的表達與腫瘤分化程度、浸潤深度、是否有淋巴轉移、是否有脈管侵犯等臨床資料無關（P>0.05）。
　　結論：
　?。?）miR-30c在胃癌組織中呈低表達，并通過改變細胞增殖、凋亡和細胞周期參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展。
　　（2）miR-30c表達下調水平與患者年齡相關。
　　(3)miR-30c對BCL9的調節(jié)關系在不同分化細胞系中影響不一，可能是多