Exosome內(nèi)TRIM3在胃癌進(jìn)展中的作用及機(jī)制.pdf

1、目的：
　　分析及鑒定胃癌來源外泌體（exosome）的形態(tài)、直徑大小及濃度，篩選其exosome內(nèi)差異表達(dá)蛋白；明確差異表達(dá)蛋白 TRIM3在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和遷移的影響；探討TRIM3通過exosome傳遞到胃癌細(xì)胞后如何影響其增殖和遷移能力；本研究旨在揭示TRIM3在胃癌診斷、發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制，為胃癌分子診斷與治療提供新的指標(biāo)和靶點(diǎn)。
　　方法：
　?。?）采用透射電子顯微鏡觀察胃癌患者和健康者血

2、清e(cuò)xosome，胃癌細(xì)胞和胃粘膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清e(cuò)xosome形態(tài)、直徑大?。煌ㄟ^Nanosight納米顆粒分析儀對(duì)exosome的直徑及濃度進(jìn)行檢測(cè)分析。
　　（2）應(yīng)用高效液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀對(duì)胃癌患者和健康者血清e(cuò)xosome內(nèi)蛋白進(jìn)行檢測(cè)分析，篩選出差異表達(dá)的蛋白；采用ELISA及Western blot方法對(duì)胃癌患者和健康者血清e(cuò)xosome內(nèi)差異蛋白TRIM3進(jìn)行驗(yàn)證；qRT-PCR及免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)胃癌組織及癌旁組織

3、中差異蛋白 TRIM3的表達(dá)水平；qRT-PCR及Western blot方法檢測(cè)胃癌細(xì)胞及其培養(yǎng)上清中差異蛋白TRIM3的表達(dá)水平。
　?。?）構(gòu)建TRIM3表達(dá)載體、設(shè)計(jì)TRIM-siRNA干擾片段實(shí)現(xiàn)TRIM3的過表達(dá)/干擾；平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察TRIM3過表達(dá)/干擾對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響及干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子SOX2和OCT4的變化；Transwell實(shí)驗(yàn)觀察TRIM3過表達(dá)/干擾對(duì)胃癌細(xì)胞遷移能力的影響及 EMT相關(guān)指標(biāo)的變化；

4、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察 TRIM3過表達(dá)/干擾對(duì)裸鼠皮下瘤增殖及增殖相關(guān)指標(biāo)PCNA表達(dá)的影響，對(duì)腹腔轉(zhuǎn)移瘤中瘤組織的數(shù)量及EMT相關(guān)指標(biāo)表達(dá)的影響。
　　（4）使用CM-Dil染料對(duì)exosome進(jìn)行染色與胃癌細(xì)胞共孵育，激光共聚焦顯微鏡及流式成像儀觀察胃癌細(xì)胞對(duì) exosome的內(nèi)化；將 TRIM3過表達(dá)的exosome作用于胃癌細(xì)胞觀察細(xì)胞增殖和遷移的變化，以及對(duì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子SOX2、OCT4和EMT相關(guān)指標(biāo)的影響；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察TR

5、IM3過表達(dá)exosome作用的胃癌細(xì)胞對(duì)裸鼠皮下瘤及腹腔轉(zhuǎn)移瘤形成能力的影響。
　?。?）生物信息學(xué)預(yù)測(cè)靶向TRIM3的miRNA，并使用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)其在胃癌血清e(cuò)xosome及胃癌組織內(nèi)的表達(dá)水平；尋找TRIM3參與的下游重要信號(hào)通路，明確其與信號(hào)通路中重要相關(guān)分子的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　（1）胃癌血清來源的exosome，具有典型的“碟狀”或“杯狀”形態(tài)，且濃度顯著高于健康對(duì)照組，兩組exosome的

6、直徑大小無差異；胃癌細(xì)胞培養(yǎng)上清e(cuò)xosome，具有典型的“碟狀”或“杯狀”形態(tài)，MGC-803、SGC-7901兩株胃癌細(xì)胞培養(yǎng)上清來源exosome的濃度較GES-1來源的exosome高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩株細(xì)胞培養(yǎng)上清e(cuò)xosome的直徑大小無差異。
　　（2）通過質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，胃癌患者血清與健康者血清e(cuò)xosome內(nèi)共存在243個(gè)差異表達(dá)的蛋白，共33個(gè)蛋白具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中TRIM3表達(dá)差異顯著；擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證發(fā)

7、現(xiàn)胃癌患者血清e(cuò)xosome內(nèi)TRIM3的表達(dá)明顯低于健康人；胃癌組織中TRIM3的表達(dá)水平也較癌旁組織低；胃癌細(xì)胞及其培養(yǎng)上清e(cuò)xosome內(nèi)TRIM3的含量與胃粘膜上皮細(xì)胞相比顯著降低。
　?。?）TRIM3過表達(dá)可以抑制胃癌細(xì)胞在體外的增殖和遷移，使干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)減弱，抑制EMT發(fā)生；抑制胃癌細(xì)胞在體內(nèi)的增殖和遷移，腫瘤大小、體積均小于對(duì)照組，且腹腔轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)量也明顯較對(duì)照組少。TRIM3干擾可以增強(qiáng)胃癌細(xì)胞在體外的增殖

8、和遷移能力，使干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)EMT發(fā)生；可以增強(qiáng)胃癌細(xì)胞在體內(nèi)的增殖和遷移能力，腫瘤大小、體積均大于對(duì)照組，且腹腔轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)量也明顯較對(duì)照組增多。
　?。?）TRIM3過表達(dá)的胃癌細(xì)胞可以通過exosome傳遞大量的TIRM3到靶細(xì)胞。50μg exosome作用胃癌細(xì)胞后，能抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移能力，使干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)下調(diào)，抑制 EMT發(fā)生，E-cadherin表達(dá)上調(diào)、N-cadherin和Vimentin

9、表達(dá)下調(diào)；在體內(nèi)的增殖和遷移能力減弱，腫瘤大小、體積均小于對(duì)照組，且腹腔轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)量也明顯較對(duì)照組減少。
　?。?）生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)TRIM3為miRNA-20a的直接靶基因，并通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)確證。胃癌患者血清來源的exosome及胃癌組織內(nèi)miRNA-20a呈高表達(dá)，且與TRIM3表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。TRIM3的表達(dá)變化可以影響Wnt/β-catenin信號(hào)通路中的Wnt4和β-catenin分子的變化，TRIM3的

10、表達(dá)下調(diào)可以使wnt4和β-catenin的表達(dá)增強(qiáng)。
　　結(jié)論：
　　胃癌患者血清 exosome的濃度及 exosome內(nèi)容物與健康者有顯著差異；血清e(cuò)xosome和exosome內(nèi)TRIM3可能成為胃癌輔助診斷的新型標(biāo)志物；exosome攜載的TRIM3在胃癌的增殖和遷移中具有明顯的作用，且與血清miRNA-20a呈負(fù)相關(guān)；TRIM3參與胃癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制與Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。本研究為胃癌的診斷與治