miRNA-424-5p在胰腺癌中的作用及機制研究.pdf

1、研究背景:
　　胰腺癌是消化系統(tǒng)比較常見的惡性腫瘤之一，已經成為美國癌癥相關死亡原因的第四位。大多數患者在胰腺癌診斷后的12個月后死亡，診斷后能夠存活5年者極少。胰腺癌預后差，歸因于臨床癥狀出現較晚，早期局部侵犯和高度轉移潛能，大多數患者一經診斷即失去手術機會，而胰腺癌患者能夠獲得較長生存率的唯一的機會便是能夠進行根治性手術切除。胰腺癌被認為是一個復雜的與多種基因有關的疾病。迄今為止，多條信號通路與眾多的生長因子、癌基因和抑癌基因

2、等的異常表達或激活參與了胰腺癌的發(fā)生及發(fā)展過程。因此探索胰腺癌的發(fā)病機制、尋找新的診斷生物標記物和治療靶點是提高治療效果的關鍵。
　　MicroRNA（miRNA）是近些年來被發(fā)現的一類非編碼單鏈小RNA分子，其參與了眾多的生物學過程，例如生長、增殖、分化和凋亡等過程。miRNA通過與它們的靶向mRNA的3'UTR區(qū)以堿基互補配對的方式結合，導致mRNA降解或抑制其翻譯，通過這種機制miRNA降低了靶基因蛋白的表達水平。miRNA

3、的這種負性調節(jié)與多種人類腫瘤密切相關，比如胰腺癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、結直腸癌等。因此深入研究miRNA在人體腫瘤中的表達及其功能，對探索腫瘤的發(fā)病機制具有重要意義，并將有利于對腫瘤的診斷、治療及預后的判斷。ERK1/2信號通路已成為腫瘤發(fā)生發(fā)展相關因素的研究熱點。研究表明ERK1/2可參與多種生物學反應包括細胞增殖與分化、細胞骨架的構建、細胞形態(tài)維持、細胞凋亡等。然而ERK1/2在胰腺癌中的作用卻知之甚少。
　　目的:

4、r>　　檢測miR-424-5p在胰腺癌中的表達的情況，探討miR-424-5p在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉移中的相關功能機制，分析miR-424-5p的靶基因SOCS6與胰腺癌臨床病理因素的關系，同時研究miR-424-5p對ERK1/2信號通路的影響。
　　方法:
　　1.收集2009年9月-2012年9月在中南大學湘雅醫(yī)院手術切除的胰腺癌組織新鮮標本及其癌旁組織各30例，正常胰腺組織標本10例作為對照組。采用實時熒光定量

5、real-time PCR方法檢測miR-424-5p在胰腺癌、癌旁及正常胰腺組織中的表達情況。同時用real-time PCR和western blot方法檢測SOCS6的表達情況。分析miR-424-5p與SOCS6的表達之間的關系及SOCS6與胰腺癌患者臨床病理關系。
　　2.選取四個胰腺癌細胞系PANC-1、PC-2、SW1990、CFPAC-1用real-time PCR方法檢測miR-424-5p的表達差異。選取miR

6、-424-5p高表達的細胞系進行后續(xù)試驗。將hsa-miR-424-5p inhibitor使用脂質體Lipofectamine2000轉染入PANC-1細胞，同時設置陰性對照組和空白對照組。Real-time PCR檢測轉染后miR-424-5p的表達情況。同時用real-time PCR和western blot方法檢測下游靶點SOCS6的表達水平。MTT法檢測細胞的增殖并繪制生長曲線;流式細胞術檢測細胞的凋亡和細胞周期;Trans

7、well法檢測細胞遷移和侵襲的能力。
　　3.運用生物信息學(miRbase， TargetScan， miRanda)的方法，預測SOCS6為其可能的下游靶點并用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)驗證。
　　4.選取PANC-1細胞系，轉染miR-424-5p inhibitor及miR-424-5p inhibitor陰性對照組后，利用western blot免疫印跡實驗觀察ERK1/2蛋白在PANC-1細胞中的表達變化;實時熒光定

8、量PCR檢測ERK1/2信號通路下游Bcl-2，Mcl-1的變化情況，探討miR-424-5p對胰腺癌細胞ERK1/2信號通路的影響。
　　結果:
　　1.用real-time PCR檢測胰腺癌組織中miR-424-5p相對表達量為0.07407±0.03385，明顯高于癌旁組織的0.04601±0.03143和正常胰腺組織中的0.02792±0.01801(P＜0.05)。而SOCS6的表達狀態(tài)卻與miR-424-5p相反

9、。SOCS6在胰腺癌中的相對表達量為0.00752±0.00123，低于癌旁組織0.00883±0.00227和正常胰腺組織0.01102±0.00108(P＜0.05)。利用spearman雙變量相關分析miR-424-5p的表達情況與SOCS6表達的關系，我們得出miR-424-5p的表達情況與SOCS6表達呈負相關(R=-0.455， P=0.026)。miR-424-5p和SOCS6與患者的性別，年齡，吸煙與否，腫瘤部位，腫瘤大

10、小無明顯相關性，而與腫瘤分化程度，TNM分期和淋巴結轉移相關。
　　2.利用實時熒光定量PCR檢測到miR-424-5p在胰腺癌細胞系PANC-1中表達最高，故選取PANC-1作為下一步實驗的細胞系。PANC-1細胞轉染miR-424-5p inhibitor后real-time PCR檢測證實miR-424-5p被成功抑制。MTT法檢測細胞增殖顯示miR-424-5p抑制后24-72小時活細胞數量明顯低于對照組(P＜0.05)。

11、流式細胞技術檢測到抑制miR-424-5p后，凋亡細胞的比例增加至18.03％±2.95％，但是對細胞周期無明顯影響。抑制miR-424-5p的表達后，PANC-1細胞遷移能力約為陰性對照組的40％，侵襲能力約為陰性對照組的50％，兩者都有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　3.通過生物信息學方法結合miR-424-5p的生物學特性，SOCS6為miR-424-5p的可能靶蛋白之一，利用雙熒光素酶報告基因實驗加以驗證，分析結果顯示，

12、SOCS6是miR-424-5p的直接作用靶基因，并且作用位點位于302-308處。
　　4.PANC-1細胞中轉染miR-424-5p inhibitor后，實驗組SOCS6mRNA的相對表達量較對照組增加了30％左右;Bcl-2和Mcl-1mRNA的表達均出現一定程度的下降，約25％左右。Westernblot結果顯示miR-424-5p inhibitor組的ERK1/2蛋白表達水平明顯下調。提示miR-424-5p是通過E

13、RK1/2信號通路起作用的。
　　結論:
　　1.miR-424-5p在胰腺癌組織及胰腺癌細胞系中高表達。miR-424-5p的表達與胰腺癌患者的性別，年齡，吸煙與否，腫瘤部位，腫瘤大小無明顯相關性，而與腫瘤分化程度，TNM分期和淋巴結轉移相關。
　　2.miR-424-5p表達受到抑制后，PANC-1細胞增殖減慢、侵襲遷移能力降低、凋亡細胞數增多，miR-424-5p可能成為胰腺癌基因治療的一個潛在靶點用生物信息學方