TGF-β在胃癌免疫逃逸中作用及機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進(jìn)行了論述：
　　第一部分 TGF-β誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞HLA-G表達(dá)機(jī)制的研究
　　研究目的：
　　研究TGF-β誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞HLA-G的表達(dá)及可能作用機(jī)制。
　　研究方法：
　　通過臨床工作獲取山東大學(xué)齊魯醫(yī)院20例胃癌患者胃癌組織及癌旁組織標(biāo)本，同時(shí)采集術(shù)前1天相應(yīng)患者的外周血標(biāo)本。所有患者術(shù)前檢查均未發(fā)現(xiàn)其他臟器腫瘤病變，均接受根治性胃癌切除手術(shù)，術(shù)前均未接受針對(duì)腫瘤的放療、化療及免疫

2、治療，所有腫瘤標(biāo)本均經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)。經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有納入實(shí)驗(yàn)的胃癌患者均在術(shù)前簽署病情及實(shí)驗(yàn)知情同意書。
　　1.研究數(shù)據(jù)來源:
　　2.組織標(biāo)本以及特殊器械準(zhǔn)備
　　3.組織病理學(xué)制備
　　4.相應(yīng)外周血標(biāo)本中可溶性HLA-G(sHLA-G)濃度檢測
　　5.通過ELISA對(duì)TGF-β和HLA-G的檢測
　　6.應(yīng)用TGF-β kit、sHLA-Gkit檢測胃癌細(xì)胞TGF-β與HLA-G的

3、濃度。
　　7.統(tǒng)計(jì)分析
　　研究結(jié)果：
　　1.在實(shí)驗(yàn)中對(duì)TGF-β及HLA-G的濃度進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)通過皮爾森的回歸分析出一個(gè)強(qiáng)烈的正相關(guān)關(guān)系(R2=0.5455; P＜0.001)。
　　2.ELISA實(shí)驗(yàn)分析表明TGF-β處理后48小時(shí)，HLA-G水平增高(*P＜0.05**P＜0.01)。
　　3.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著TGF-β逐步升高的濃度和處理時(shí)間的增加，結(jié)果顯示，HLA-G表達(dá)逐漸上調(diào)。
　　

4、研究結(jié)論:
　　1.在胃癌細(xì)胞以及組織中TGF-β及HLA-G呈高表達(dá)水平，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示兩者的表達(dá)呈相關(guān)性。
　　2.在胃癌中不同濃度TGF-β刺激能上調(diào)HLA-G不同程度表達(dá)。TGF-β表達(dá)和HLA-G的表達(dá)在胃癌組織中及外周血中的濃度呈顯著正相關(guān)。
　　3.TGF-β參與了胃癌組織中HLA-G的表達(dá)上調(diào)說明TGF-β和HLA-G在胃癌組織及外周血中的蛋白水平呈正相關(guān);進(jìn)一步闡明TGF-β不僅與胃癌的活化和轉(zhuǎn)移相關(guān)

5、，而且在普通外科領(lǐng)域可能成為判斷胃癌患者預(yù)后的指標(biāo)之一應(yīng)用于臨床實(shí)踐。
　　第二部分 通過抑制miR-152研究TGF-β在胃癌免疫逃逸作用及機(jī)制
　　研究目的:
　　通過抑制胃癌細(xì)胞miR-152研究TGF-β及HLA-G之間的關(guān)系，進(jìn)一步探討胃癌TGF-β參與腫瘤免疫逃逸可能作用及機(jī)制。
　　研究方法:
　　在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前首先對(duì)待檢測細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇，細(xì)胞消化等處理，達(dá)到一定要求方可進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)以及下一步

6、操作
　　1.常規(guī)細(xì)胞復(fù)蘇以及細(xì)胞培養(yǎng)，傳代
　　2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
　　3.熒光素酶檢測
　　4.RNA分離，qRT-PCR以檢測HLA-G mRNA和TGF-β
　　在本實(shí)驗(yàn)中我們采用Trizol法提取胃癌細(xì)胞中的總RNA，為了檢測HLA-GmRNA和TGF-β，按產(chǎn)品說明書使用SuperScriptⅢ Reverse Transcriptase將oligo-dTprimers標(biāo)定的RNA反轉(zhuǎn)錄入c

7、DNA，在本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)對(duì)比以及檢索我們最終選用磷酸甘油酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參。為了檢測成熟的miR-152，用mirVanamiRNA Isolation kit提取小RNA，用小核RNA U6作為內(nèi)參。然后在實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)中，ABI7300 SYBR預(yù)混料應(yīng)用ExTaq酶來作為中介。之后按照Takara公司的ABI7300實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測以及整理結(jié)果，統(tǒng)計(jì)并分

8、析。采用比較閾值法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行相對(duì)定量分析。
　　5.分別對(duì)不同濃度以及時(shí)間的TGF-β及HLA-G濃度檢測以及miR-152表達(dá)的檢測.
　　用ELISA法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞株培養(yǎng)上清液，使用TGF-βELISA kit檢測不同濃度的TGF-β，采用sHLA-G儀器檢測可溶性HLA-G的濃度。然后檢測miR-152濃度并分析之間關(guān)系。
　　6統(tǒng)計(jì)分析
　　以上所統(tǒng)計(jì)結(jié)果我們所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((X)±SD)表

9、示來進(jìn)行。單因素方差分析或x2檢驗(yàn)法分析組間的差異。用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05被認(rèn)為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果：
　　1.經(jīng)應(yīng)用不同濃度TGF-β（2.5，5或10ng/ml）24h刺激下，發(fā)現(xiàn)同時(shí)HLA-GmRNA表達(dá)不同程度上升(圖2B)。
　　2.經(jīng)實(shí)驗(yàn)在TGF-β高表達(dá)的細(xì)胞和干擾細(xì)胞株中檢測到了不同濃度的miR-152。而在試管（體外）中TGF-β能誘導(dǎo)miR-152顯著

10、下調(diào)（P＜0.01;圖3），說明在胃癌細(xì)胞TGF-β可能抑制miR-152。
　　3.在轉(zhuǎn)染48h后觀察，抑制的miR-152與HLA-G有較一致上升趨勢(shì)，這說明在胃癌BGC823和SGC7901細(xì)胞株中miR-152改變并調(diào)節(jié)了HLA-G的表達(dá)(圖4G)。
　　4.通過比較分析不同濃度miR-152和不同濃度的TGF-β對(duì)HLA-G表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示:miR-152下調(diào)HLA-G，TGF-β上調(diào)HLA-G（如圖4）。

11、經(jīng)過細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，從熒光素酶檢測結(jié)果顯示HLA-G3'非翻譯區(qū)呈現(xiàn)負(fù)調(diào)節(jié)(圖4c)，同時(shí)觀察到Mut-HLA-G3'UTR沒有明顯的規(guī)律（圖4E、F）。
　　5.經(jīng)處理應(yīng)用不同的miR-152 mimics，miR-152 inhibitor以及negative controlRNA與miR-152 mimics control不同水平檢測發(fā)現(xiàn)抑制miR-152可以向上調(diào)節(jié)HLA-G表達(dá)，同時(shí)抑制TGF-β誘導(dǎo)HLA-G表達(dá)

12、的改變(*P＜0.05，**P＜0.01)。
　　6.經(jīng)過檢測發(fā)現(xiàn)，在上調(diào)TGF-β濃度時(shí)，加入miR-152 mimics后則部分下調(diào)，間接說明HLA-G表達(dá)與miR-152成反比例關(guān)系（圖7A、B）(*P＜0.05，**P＜0.01)。作線形圖發(fā)現(xiàn)HLA-G濃度與miR-152成反比例關(guān)系(R2=0.5267; P＜0.001)。同時(shí)TGF-β濃度與miR-152成反比例關(guān)系(R2=0.5944; P＜0.001)。
　

13、　研究結(jié)論：
　　1.研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的胃癌細(xì)胞TGF-β刺激可產(chǎn)生不同濃度的miR-152，反之亦然，說明兩者之間有交互影響。
　　2.通過分析以上結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)通過抑制miR-152可促進(jìn)胃癌細(xì)胞TGF-β的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在胃癌組織miR-152表達(dá)水平與TGF-β表現(xiàn)成反比。
　　3.HLA-G表達(dá)和miR-152濃度之間存在顯著負(fù)性相關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞株中miR-152呈低表達(dá);實(shí)驗(yàn)表明具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

14、
　　4.結(jié)果顯示抑制miR-152轉(zhuǎn)錄活性后，胃癌細(xì)胞中TGF-β可以誘導(dǎo)HLA-G的表達(dá)。這對(duì)胃癌細(xì)胞的活化起著重要作用并對(duì)進(jìn)一步研究胃癌TGF-β免疫逃逸機(jī)制有重要的意義。
　　意義:經(jīng)以上研究發(fā)現(xiàn)通過抑制miR-152轉(zhuǎn)錄活性可以增加胃癌TGF-β和HLA-G表達(dá)水平，該發(fā)現(xiàn)可能揭示胃癌TGF-β免疫逃逸機(jī)制。本次實(shí)驗(yàn)在國內(nèi)外已發(fā)表的實(shí)驗(yàn)以及臨床研究中未見有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)揭示miR-152通過抑制胃癌TGF-β誘導(dǎo)HL