黃芪水提物促腎臟水鈉排泄及腎臟保護(hù)作用的細(xì)胞分子機(jī)制研究.pdf

1、黃芪是治療腎臟疾病的常用中藥，文獻(xiàn)報(bào)道黃芪能排鈉利尿及減輕蛋白尿、保護(hù)腎功能，但其作用機(jī)制目前尚未完全闡明。本文首次采用臨床試驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)從ANF-cGMP-PDE5信號(hào)通路角度全面闡明了黃芪水提物(ARE)促腎臟水鈉排泄作用的分子機(jī)制；此外，本文還在整體、細(xì)胞、分子三個(gè)層次，從足細(xì)胞粘附分子α-dystroglycan和α<,3>β<,1>整合素角度深入研究了ARE對(duì)足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其分子機(jī)制，為腎臟疾病的治療提供

2、了新思路。 第一部分：黃芪水提物促腎臟水鈉排泄的作用及分子機(jī)制。 一、黃芪水提物促健康人尿鈉排泄的臨床試驗(yàn)。 目的： 研究黃芪水提物(ARE)對(duì)健康人的利尿利鈉作用并探討其機(jī)制。 方法： 采用雙盲交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)，12名健康男性志愿者口服生理鹽水(10ml/kg)擴(kuò)容后，隨機(jī)分為黃芪水提物(ARE)組(0.3g/kg)和安慰劑組，觀察給藥后4小時(shí)內(nèi)尿量、尿鈉排泄量(UJ<,Na>V)、尿氯排泄

3、量(U<,C1>V)、尿鈉排泄分?jǐn)?shù)(FE<,Na>)、血漿ANP濃度(pANP)、尿cGMP 排泄量(U<,cGMP>V)及U<,cGMP>V/pANP變化，經(jīng)兩周洗脫期后進(jìn)行交叉試驗(yàn)。 結(jié)論： 本研究首次采用前瞻性、雙盲、隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)證實(shí)黃芪水提物(ARE)能顯著促進(jìn)健康人尿鈉排泄，其機(jī)制可能與ARE增加腎臟ANP敏感性有關(guān)。 二、黃芪水提物改善阿霉素腎病大鼠ANP抵抗的作用及機(jī)制研究。 目的：

4、 探討黃芪水提物(ARE)改善阿霉素腎病大鼠ANP抵抗的作用及機(jī)制。 方法： 一次性尾靜脈注射阿霉素(6mg/kg)建立腎病綜合征模型，將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Norm)，阿霉素腎病組(ADR)，ADR+黃芪水提物組(2.5g·kg<'-1>·d<'-1>)(ARE)及ADR+苯那普利組(10mg·kg<'-1>·d<'-1>)(ACEI)，每組12只。用藥6周后，常規(guī)檢測(cè)血、尿生化指標(biāo)、血漿和腎組織局部腎素-血管

5、緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)及腎小球?yàn)V過(guò)率(GFR)的改變。并觀察大鼠在2％體重生理鹽水?dāng)U容后的利鈉反應(yīng)、血漿ANP濃度、尿cGMP排泄量(U<,cGMP>V)及腎內(nèi)髓組織磷酸二酯酶5(PDE5)活性。采用Western blotting及實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real time-PCR)方法檢測(cè)腎內(nèi)髓組織PDE5蛋白及mRNA表達(dá)。 結(jié)論： ARE能顯著改善阿霉素腎病大鼠ANP抵抗，從而排鈉利尿，其機(jī)制可能與ARE抑

6、制ANP-cGMP信號(hào)通路的下游關(guān)鍵酶PDE5活性，尤其是抑制PDE5蛋白及mRNA表達(dá)有關(guān)。 三、黃芪水提物對(duì)mIMCD-3細(xì)胞PDE5活性及表達(dá)的影響。 目的： 研究黃芪水提物(ARE)對(duì)mIMCD-3細(xì)胞磷酸二酯酶5(PDE5)活性及表達(dá)的影響。 方法： 體外培養(yǎng)條件性永生的小鼠mIMCD-3細(xì)胞，用10<'-7>M濃度ANP刺激 cGMP 產(chǎn)生，加入 500、1000、2000μg/ml的

7、ARE進(jìn)行干預(yù)，并設(shè)立空白對(duì)照組(Control)和PDE5 抑制劑(Sildenafil)陽(yáng)性對(duì)照組，培養(yǎng)12h。觀察ARE對(duì)mIMCD-3細(xì)胞cGMP產(chǎn)生量、PDE5活性及蛋白和mRNA表達(dá)水平的影響。 結(jié)論： ARE能顯著增加體外培養(yǎng)的mIMCD-3細(xì)胞ANP敏感性，提高cGMP產(chǎn)生量，ARE對(duì)ANP-cGMP信號(hào)通路的下游關(guān)鍵酶PDE5具有一定調(diào)控作用，尤其是抑制PDE5蛋白和mRNA表達(dá)是其作用的機(jī)制之一。

8、 第二部分：黃芪水提物對(duì)腎小球足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及分子機(jī)制。 一、黃芪水提物對(duì)阿霉素腎病大鼠足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用 目的： 探討黃芪水提物對(duì)阿霉素腎病大鼠足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。 方法： 一次性尾靜脈注射阿霉素6mg/kg 建立阿霉素腎病模型，將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Norm)、阿霉素腎病模型組(ADR)、ADR+黃芪水提物組(2.5g·kg<'-1>·d<'-1>)(ARE)及ADR+

9、苯那普利組(10mg·kg<'-1>·d<'-1>)(ACEI)，每組12只。用藥10周后，用雙縮脲法測(cè)定 24h 尿蛋白定量，并行腎組織病理學(xué)檢查。用WT1 免疫組化染色進(jìn)行足細(xì)胞計(jì)數(shù)，并計(jì)算單位腎小球面積上的足細(xì)胞數(shù)。采用免疫組化及Western blotting方法檢測(cè)腎皮質(zhì)α-dystroglycan、α<,3> integrin蛋白表達(dá)，用Real time-PCR方法檢測(cè)其mRNA表達(dá)。 結(jié)論： 黃芪水提物(

10、ARE)能保護(hù)阿霉素腎病大鼠足細(xì)胞損傷，減輕蛋白尿，其機(jī)制可能與ARE上調(diào)足突一基底膜粘附分子α-dystroglycan及α<,3> integrin表達(dá)，緩解足細(xì)胞剝離和脫落有關(guān)。 二、黃芪水提物對(duì)體外培養(yǎng)的足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。 目的： 研究黃芪水提物(ARE)對(duì)體外培養(yǎng)的足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。 方法： 體外培養(yǎng)條件性永生的小鼠足細(xì)胞，分為(1)對(duì)照組(Control):加入PB

11、S；(2)阿霉素刺激組(ADR)：加入50μg/ml ADR；(3)ADR+黃芪水提物干預(yù)組(ARE)：加入500，1000，2000μg/ml濃度的ARE干預(yù)。用顯微鏡下直接計(jì)數(shù)法和熒光定量試劑盒方法測(cè)定足細(xì)胞粘附功能，用每孔離心后的細(xì)胞數(shù)與離心前的細(xì)胞數(shù)比例(％)以及每孔細(xì)胞的熒光強(qiáng)度值反映足細(xì)胞粘附能力，Western blotting和Real-Time PCR檢測(cè)足細(xì)胞α-dystroglycan、α<,3> integrin

12、蛋白和mRNA表達(dá)。 結(jié)論： 黃芪水提物(ARE)對(duì)體外培養(yǎng)的阿霉素刺激下的足細(xì)胞損傷有明顯保護(hù)作用，其機(jī)制可能與ARE上調(diào)粘附分子α-dystroglycan、α<,3> integrin蛋白及mRNA表達(dá)，改善足細(xì)胞與基底膜之間粘附功能有關(guān)。 綜合以上兩大部分內(nèi)容，得出以下結(jié)論： 1.黃芪水提物(ARE)能顯著促進(jìn)健康人及阿霉素腎病大鼠腎臟水鈉排泄，其機(jī)制與ARE影響ANP-cGMP-PDE5信號(hào)通路