黃芪水提物促腎臟水鈉排泄及腎臟保護作用的細胞分子機制研究.pdf

1、黃芪是治療腎臟疾病的常用中藥，文獻報道黃芪能排鈉利尿及減輕蛋白尿、保護腎功能，但其作用機制目前尚未完全闡明。本文首次采用臨床試驗、動物實驗及體外細胞實驗從ANF-cGMP-PDE5信號通路角度全面闡明了黃芪水提物(ARE)促腎臟水鈉排泄作用的分子機制；此外，本文還在整體、細胞、分子三個層次，從足細胞粘附分子α-dystroglycan和α<,3>β<,1>整合素角度深入研究了ARE對足細胞損傷的保護作用及其分子機制，為腎臟疾病的治療提供

2、了新思路。 第一部分：黃芪水提物促腎臟水鈉排泄的作用及分子機制。 一、黃芪水提物促健康人尿鈉排泄的臨床試驗。 目的： 研究黃芪水提物(ARE)對健康人的利尿利鈉作用并探討其機制。 方法： 采用雙盲交叉試驗設計，12名健康男性志愿者口服生理鹽水(10ml/kg)擴容后，隨機分為黃芪水提物(ARE)組(0.3g/kg)和安慰劑組，觀察給藥后4小時內(nèi)尿量、尿鈉排泄量(UJ<,Na>V)、尿氯排泄

3、量(U<,C1>V)、尿鈉排泄分數(shù)(FE<,Na>)、血漿ANP濃度(pANP)、尿cGMP 排泄量(U<,cGMP>V)及U<,cGMP>V/pANP變化，經(jīng)兩周洗脫期后進行交叉試驗。 結(jié)論： 本研究首次采用前瞻性、雙盲、隨機對照臨床試驗證實黃芪水提物(ARE)能顯著促進健康人尿鈉排泄，其機制可能與ARE增加腎臟ANP敏感性有關(guān)。 二、黃芪水提物改善阿霉素腎病大鼠ANP抵抗的作用及機制研究。 目的：

4、 探討黃芪水提物(ARE)改善阿霉素腎病大鼠ANP抵抗的作用及機制。 方法： 一次性尾靜脈注射阿霉素(6mg/kg)建立腎病綜合征模型，將大鼠隨機分為正常對照組(Norm)，阿霉素腎病組(ADR)，ADR+黃芪水提物組(2.5g·kg<'-1>·d<'-1>)(ARE)及ADR+苯那普利組(10mg·kg<'-1>·d<'-1>)(ACEI)，每組12只。用藥6周后，常規(guī)檢測血、尿生化指標、血漿和腎組織局部腎素-血管

5、緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)及腎小球濾過率(GFR)的改變。并觀察大鼠在2％體重生理鹽水擴容后的利鈉反應、血漿ANP濃度、尿cGMP排泄量(U<,cGMP>V)及腎內(nèi)髓組織磷酸二酯酶5(PDE5)活性。采用Western blotting及實時定量聚合酶鏈反應(Real time-PCR)方法檢測腎內(nèi)髓組織PDE5蛋白及mRNA表達。 結(jié)論： ARE能顯著改善阿霉素腎病大鼠ANP抵抗，從而排鈉利尿，其機制可能與ARE抑

6、制ANP-cGMP信號通路的下游關(guān)鍵酶PDE5活性，尤其是抑制PDE5蛋白及mRNA表達有關(guān)。 三、黃芪水提物對mIMCD-3細胞PDE5活性及表達的影響。 目的： 研究黃芪水提物(ARE)對mIMCD-3細胞磷酸二酯酶5(PDE5)活性及表達的影響。 方法： 體外培養(yǎng)條件性永生的小鼠mIMCD-3細胞，用10<'-7>M濃度ANP刺激 cGMP 產(chǎn)生，加入 500、1000、2000μg/ml的

7、ARE進行干預，并設立空白對照組(Control)和PDE5 抑制劑(Sildenafil)陽性對照組，培養(yǎng)12h。觀察ARE對mIMCD-3細胞cGMP產(chǎn)生量、PDE5活性及蛋白和mRNA表達水平的影響。 結(jié)論： ARE能顯著增加體外培養(yǎng)的mIMCD-3細胞ANP敏感性，提高cGMP產(chǎn)生量，ARE對ANP-cGMP信號通路的下游關(guān)鍵酶PDE5具有一定調(diào)控作用，尤其是抑制PDE5蛋白和mRNA表達是其作用的機制之一。

8、 第二部分：黃芪水提物對腎小球足細胞損傷的保護作用及分子機制。 一、黃芪水提物對阿霉素腎病大鼠足細胞損傷的保護作用 目的： 探討黃芪水提物對阿霉素腎病大鼠足細胞損傷的保護作用及機制。 方法： 一次性尾靜脈注射阿霉素6mg/kg 建立阿霉素腎病模型，將大鼠隨機分為正常對照組(Norm)、阿霉素腎病模型組(ADR)、ADR+黃芪水提物組(2.5g·kg<'-1>·d<'-1>)(ARE)及ADR+

9、苯那普利組(10mg·kg<'-1>·d<'-1>)(ACEI)，每組12只。用藥10周后，用雙縮脲法測定 24h 尿蛋白定量，并行腎組織病理學檢查。用WT1 免疫組化染色進行足細胞計數(shù)，并計算單位腎小球面積上的足細胞數(shù)。采用免疫組化及Western blotting方法檢測腎皮質(zhì)α-dystroglycan、α<,3> integrin蛋白表達，用Real time-PCR方法檢測其mRNA表達。 結(jié)論： 黃芪水提物(

10、ARE)能保護阿霉素腎病大鼠足細胞損傷，減輕蛋白尿，其機制可能與ARE上調(diào)足突一基底膜粘附分子α-dystroglycan及α<,3> integrin表達，緩解足細胞剝離和脫落有關(guān)。 二、黃芪水提物對體外培養(yǎng)的足細胞損傷的保護作用及機制。 目的： 研究黃芪水提物(ARE)對體外培養(yǎng)的足細胞損傷的保護作用及機制。 方法： 體外培養(yǎng)條件性永生的小鼠足細胞，分為(1)對照組(Control):加入PB

11、S；(2)阿霉素刺激組(ADR)：加入50μg/ml ADR；(3)ADR+黃芪水提物干預組(ARE)：加入500，1000，2000μg/ml濃度的ARE干預。用顯微鏡下直接計數(shù)法和熒光定量試劑盒方法測定足細胞粘附功能，用每孔離心后的細胞數(shù)與離心前的細胞數(shù)比例(％)以及每孔細胞的熒光強度值反映足細胞粘附能力，Western blotting和Real-Time PCR檢測足細胞α-dystroglycan、α<,3> integrin

12、蛋白和mRNA表達。 結(jié)論： 黃芪水提物(ARE)對體外培養(yǎng)的阿霉素刺激下的足細胞損傷有明顯保護作用，其機制可能與ARE上調(diào)粘附分子α-dystroglycan、α<,3> integrin蛋白及mRNA表達，改善足細胞與基底膜之間粘附功能有關(guān)。 綜合以上兩大部分內(nèi)容，得出以下結(jié)論： 1.黃芪水提物(ARE)能顯著促進健康人及阿霉素腎病大鼠腎臟水鈉排泄，其機制與ARE影響ANP-cGMP-PDE5信號通路