仙草水提物對(duì)糖尿病大鼠腎臟損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、本論文首先參照衛(wèi)生部《食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序和方法》要求對(duì)仙草水提物進(jìn)行急性毒性和遺傳毒性的研究。在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型，通過病理觀察、免疫組化、ELISA、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等多種研究手段，從整體、細(xì)胞、分子等不同水平系統(tǒng)觀察了仙草水提物對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠血糖、血脂及腎功能的影響，并利用大鼠腎系膜細(xì)胞初步探討了仙草的抗脂質(zhì)過氧化特性在DN防治中的可能作用機(jī)制。
　　 第一部分：仙草水提物的急性毒性和遺傳毒性研

2、究
　　 目的：對(duì)仙草水提物進(jìn)行急性毒性和遺傳毒性的研究，為其開發(fā)利用提供部分毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：仙草經(jīng)熱水浸提、減壓濃縮和干燥粉碎后獲得棕色粉末備用。對(duì)仙草水提物進(jìn)行大、小鼠急性毒性試驗(yàn)，Ames試驗(yàn)，小鼠骨髓微核試驗(yàn)和小鼠精子畸形試驗(yàn)的研究。
　　 結(jié)果：染毒后，大、小鼠在2周的觀察期內(nèi)均未出現(xiàn)任何中毒癥狀和死亡情況；雌、雄性大小鼠對(duì)該受試物的經(jīng)口急性毒性最大耐受劑量均大于24.0g/kg體重；Am

3、es試驗(yàn)中，不同劑量受試物在加大鼠肝勻漿代謝活化系統(tǒng)和不加S9條件下的回變菌落數(shù)均未超過空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組回變菌落數(shù)的兩倍，且各劑量組間無明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系；各劑量組小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率和精子畸形率明顯低于陽性對(duì)照組，且與陰性對(duì)照組無顯著性差異。
　　 第二部分：仙草水提物對(duì)糖尿病大鼠腎臟損傷的保護(hù)作用
　　 目的：應(yīng)用STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型，觀察仙草水提物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重、血糖、血脂以及腎臟結(jié)構(gòu)和功能的影響

4、。同時(shí)，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腎組織中抗氧化指標(biāo)MDA和SOD、GSH-Px的水平，以及致纖維化因子TGF-β１、TSP-1和FN基因表達(dá)的變化，從而探討仙草水提物在DN防治中的作用及其可能的分子機(jī)制。
　　 方法：糖尿病大鼠模型制備及分組
　　 清潔級(jí)雄性SD大鼠，體重180-200g，造模前禁食10小時(shí)，以60mg/kg體重的劑量一次性腹腔注射STZ。正常對(duì)照組大鼠腹腔注射等劑量檸檬酸鹽緩沖液。72小時(shí)后大鼠尾靜脈采血，使用血

5、糖儀測(cè)定血糖水平，尿糖試紙測(cè)定尿糖水平。將血糖≥16.7mmol/L、尿糖陽性視為糖尿病大鼠模型制備成功。
　　 (1)糖尿病對(duì)照組；
　　 (2)低劑量仙草干預(yù)組；
　　 (3)中劑量仙草干預(yù)組；
　　 (4)高劑量仙草干預(yù)組；
　　 (5)吡格列酮干預(yù)組；
　　 各干預(yù)組大鼠于每周上午灌胃給予受試物一次，正常和糖尿病對(duì)照組大鼠用等量蒸餾水灌胃。實(shí)驗(yàn)期間，所有大鼠自由進(jìn)食及飲水，每天觀察

6、大鼠的一般狀況，監(jiān)測(cè)體重和血糖、尿糖水平的變化，持續(xù)給予受試物6周后處死。
　　 大鼠麻醉前先收集尿液，并置于4℃保存；然后以40mg/kg.體重的劑量腹腔注射1％戊巴比妥鈉，將大鼠充分麻醉后固定于鼠板上，打開腹腔，腹主動(dòng)脈取血，3000rpm離心15分鐘，留取血清，分裝后-70℃凍存。迅速采集腎臟標(biāo)本，取部分腎組織標(biāo)本，以4％中性甲醛固定，用于HE染色和免疫組化檢測(cè)。另取腎臟髓質(zhì)交界處皮質(zhì)1mm3大小之腎組織數(shù)小塊，以2.5％

7、戊二醛固定，用于透射電鏡檢查。余下的腎臟組織分裝后液氮凍存，用于腎勻漿中的抗氧化酶活性檢測(cè)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。
　　 血、尿標(biāo)本用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血糖、血總膽固醇、甘油三酯、低密度膽固醇酯蛋白、高密度膽固醇酯蛋白、血肌酐、血尿素氮。
　　 尿微量白蛋白采用化學(xué)發(fā)光法于全自動(dòng)蛋白分析系統(tǒng)測(cè)定。
　　 光鏡和電鏡觀察腎組織病理變化。
　　 采用試劑盒的方法檢測(cè)大鼠腎勻漿中MDA和SOD、GSH-Px

8、的水平。
　　 采用ELISA試劑盒檢測(cè)大鼠血清中OxLDL的水平。
　　 Trizol法提取腎組織中總RNA，熒光實(shí)時(shí)PCR定量檢測(cè)TGF-β1、TSP-1和FN的mRNA表達(dá)。
　　 免疫組化法標(biāo)記腎組織內(nèi)TGF-β１、TSP-1和FN的陽性細(xì)胞。
　　 結(jié)果：
　　 腹腔注射STZ后，實(shí)驗(yàn)大鼠均出現(xiàn)了不同程度的血糖升高、尿糖陽性、體重減輕、飲水量和尿量明顯增加等糖尿病典型癥狀。造模6周后，糖

9、尿病組大鼠體重明顯低于正常對(duì)照組，血糖明顯高于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；各干預(yù)組大鼠的一般狀況與糖尿病組比較有明顯改善，體重明顯高于糖尿病組，高劑量仙草干預(yù)組體重差異可見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但各干預(yù)組大鼠的血糖水平與糖尿病組比較，差異均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 糖尿病組大鼠的血尿素氮、肌酐和尿微量白蛋白水平均明顯高于正常對(duì)照組；吡格列酮和仙草低、中、高劑量干預(yù)組的尿微量白蛋白水平明顯低于糖尿病組大鼠；吡格列酮和仙草各劑量組大鼠的血尿

10、素氮和肌酐水平均未見明顯改變，顯著高于正常對(duì)照組水平。
　　 糖尿病組大鼠的血清LDL、HDL、TG和TC值明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；各劑量仙草干預(yù)組的LDL和TC水平，隨著仙草受試物濃度增大而存在降低的趨勢(shì)；吡格列酮和高劑量仙草干預(yù)組大鼠的各項(xiàng)血脂指標(biāo)除TG外均明顯下降，與糖尿病組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 肉眼觀察可見糖尿病大鼠腎臟體積增大，外觀蒼白、腫脹；在光鏡下可見部分腎小球萎縮，囊腔增大；腎小管管腔變

11、窄，上皮細(xì)胞肥大、胞漿內(nèi)出現(xiàn)糖原空泡；電鏡下發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠腎小球基底膜厚薄不均勻，部分區(qū)域呈局灶性增厚，足突排列紊亂，融合增加，腎小管上皮細(xì)胞線粒體腫脹，微絨毛排列紊亂或部分脫落，胞漿內(nèi)出現(xiàn)較多空泡。吡格列酮和仙草水提物的干預(yù)能明顯促進(jìn)糖尿病大鼠腎臟病變的好轉(zhuǎn)，光鏡下腎小球結(jié)構(gòu)相對(duì)清晰，萎縮少見，囊腔增大和腎小管上皮細(xì)胞空泡現(xiàn)象明顯改善；而電鏡下可見腎小球基底膜變清晰，足突融合、腎小管上皮細(xì)胞的線粒體腫脹、絨毛脫落和胞內(nèi)空泡現(xiàn)象明顯改

12、善。MDA含量和抗氧化酶活性的變化
　　 糖尿病大鼠腎組織的MDA含量明顯高于正常對(duì)照組，仙草低、中、高劑量干預(yù)組的MDA含量均明顯低于糖尿病組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但SOD和GSH-Px的活性未見明顯變化。吡格列酮干預(yù)組的上述指標(biāo)與正常對(duì)照組和糖尿病組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 糖尿病大鼠血清中OxLDL的含量明顯高于正常對(duì)照組；吡格列酮干預(yù)組和仙草中劑量干預(yù)組的OxLDL水平明顯低于糖尿病大鼠組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)

13、意義。
　　 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果表明：糖尿病大鼠腎組織中TSP-1、TGF-β1和FN的mRNA表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組，各干預(yù)組三種細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)與糖尿病組比較均有不同程度的下降；且隨著仙草受試物濃度的增大，TGF-β1和TSP-1的mRNA表達(dá)存在下降趨勢(shì)，但以上變化均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 免疫組化方法檢測(cè)到糖尿病大鼠腎組織切片中TGF-β1、TSP-1和FN陽性細(xì)胞數(shù)量和光密度值均明顯高于正常對(duì)照組

14、，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；各劑量仙草干預(yù)組受測(cè)細(xì)胞因子的表達(dá)顯著下降，其中仙草中劑量組的效果較為明顯，與糖尿病組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 第三部分：仙草水提物對(duì)LDL體外氧化修飾作用和腎系膜細(xì)胞TGF-β1mRNA表達(dá)的影響
　　 目的：觀察仙草水提物對(duì)血漿LDL體外氧化修飾作用的影響，以及對(duì)OxLDL誘導(dǎo)的大鼠腎系膜細(xì)胞TGF-β1等細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄的影響，探討仙草水提物對(duì)糖尿病大鼠腎臟保護(hù)作用的可能機(jī)制。
　　

15、 方法：采用序列超速離心和Sepharose6B凝膠過濾分離純化的LDL，用10μmol/LCu2+進(jìn)行氧化誘導(dǎo)，獲得OxLDL。在Cu2+誘導(dǎo)過程中加入不同濃度的仙草水提物，觀察其對(duì)體外Cu2+誘導(dǎo)的LDL氧化修飾作用的影響，結(jié)果用瓊脂糖凝膠電泳遷移率和硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)表示。體外培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、氧化誘導(dǎo)組和仙草25、50和125μg/ml干預(yù)組，以維生素E作為陽性對(duì)照組。細(xì)胞共孵育24h后Trizol提

16、取總RNA，熒光定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞TGF-β1、TSP-1、FN的mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)果：仙草水提物能明顯對(duì)抗Cu2+誘導(dǎo)的LDL氧化，其中高濃度組仙草水提物的遷移率與LDL未氧化組和VitE干預(yù)組幾乎相同，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。25-125μg/ml仙草水提物均可顯著抑制過氧化脂質(zhì)的生成，與氧化修飾組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；50μg/ml以上濃度仙草干預(yù)組的LPO抑制率趨于穩(wěn)定，接近氧化修飾組的5

17、0％。腎系膜細(xì)胞在OxLDL誘導(dǎo)下TGF-β1、FN的mRNA生成明顯增加，仙草低、中、高各劑量組能非常顯著地抑制腎系膜細(xì)胞在OxLDL誘導(dǎo)下TGF-β1mRNA的產(chǎn)生，抑制效果高于VitE對(duì)照組；對(duì)FN的抑制效果分別為對(duì)照組的1.40±0.09，1.33±0.16和1.17±0.21倍，其中高劑量組與誘導(dǎo)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 1、仙草水提物在本實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物未見急性毒性和致突變作用

18、。
　　 2、仙草水提物可顯著增加STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的體重，改善一般狀況，但對(duì)血糖無明顯作用。
　　 3、仙草水提物對(duì)糖尿病大鼠腎臟損傷具有一定的保護(hù)作用。
　　 4、仙草水提物具有顯著的抗脂質(zhì)過氧化、調(diào)節(jié)血脂和抑制糖尿病大鼠腎組織TGF-β1生成的作用。
　　 5、仙草水提物能有效抑制Cu2+體外誘導(dǎo)的人血清LDL氧化修飾。
　　 6、仙草水提物能明顯抑制OxLDL誘導(dǎo)的大鼠腎系膜細(xì)胞TGF