免疫組織化學(xué)和微量肌肉組織Western blotting在肌營(yíng)養(yǎng)不良診斷中應(yīng)用.pdf

1、[背景]肌營(yíng)養(yǎng)不良(muscular dystrophy，MD)是一組遺傳性肌肉疾病，主要表現(xiàn)為不同部位的肌肉不同程度的進(jìn)行性萎縮和無(wú)力。根據(jù)其臨床表現(xiàn)可分為Duchenne型(Duchenne muscular dystrophy，DMD)、Becker型(Becker musculardystrophy，BMD)、肢帶型、面肩肱型、眼咽型、先天型、Emery-Dreifuss型。最常見(jiàn)的為Duchenne型/Becker型。該型為X

2、性連鎖的主要是男性發(fā)病的遺傳性肌病。DMD是一種快速進(jìn)展性肌病，表現(xiàn)為對(duì)稱(chēng)性肢體無(wú)力，四肢近端較遠(yuǎn)端嚴(yán)重，腓腸肌假性肥大。一般12歲之前喪失獨(dú)立行走能力。還可伴有擴(kuò)張性心肌病、智能低下、夜盲等。大多在15-25歲死亡，主要死于呼吸或心臟衰竭。血清肌酸激酶(creatine kinase，CK)升高。BMD相對(duì)良性，病情進(jìn)展相對(duì)較慢。大多在7歲以后發(fā)病，在肌肉萎縮和無(wú)力分布上與DMD非常相似的。運(yùn)動(dòng)時(shí)可出現(xiàn)小腿疼痛。也可出現(xiàn)腓腸肌假性肥大

3、。16-80歲左右喪失獨(dú)立行走能力。血清CK也升高。由于dystrophin蛋白及基因突變所致的疾病，除了DMD/BMD，還可出現(xiàn)心肌病、肌肉痙攣/肌痛綜合征、女性攜帶者、精神發(fā)育遲滯及染色體Xp21鄰近基因綜合征等表現(xiàn)，統(tǒng)稱(chēng)為抗肌萎縮蛋白病(dystrophinopathy)。肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良(Limb-girdle muscular dystrophy，LGMD)是一組具有共同臨床表現(xiàn)但是發(fā)病機(jī)制迥異的疾病。該組疾病表現(xiàn)為骨盆帶肌和

4、肩帶肌進(jìn)行性無(wú)力、萎縮。LGMD臨床癥狀可具有明顯的差異，有的患者發(fā)病年齡小于10歲，病情較重，臨床進(jìn)展迅速；有的患者發(fā)病較晚，臨床癥狀較輕，進(jìn)展緩慢[33]。LGMD被分為常染色體顯性遺傳的LGMD(AD-LGMD或LGMD1)和常染色體隱性遺傳的LGMD(AR-LGMD或LGMD2)。再根據(jù)基因和蛋白缺陷分為不同的亞型。Tagawa等在研究發(fā)現(xiàn)LGMD2B在LGMD中占19％，LGMD2A為21％。在日本，LGMD發(fā)病位于第二位的亞

5、型是LGMD2B。目前分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，關(guān)于該組疾病的責(zé)任基因及編碼蛋白已逐漸被人們所認(rèn)識(shí)，并逐漸應(yīng)用在診斷上。目前國(guó)內(nèi)對(duì)于此方面的研究相對(duì)較少。
　　 [目的]1、評(píng)價(jià)IHC和WB在dystrophinopathy診斷中各自的優(yōu)勢(shì)。優(yōu)化蛋白水平的診斷方法。2、對(duì)于臨床表現(xiàn)不典型的dystrophinopathy病例，依靠IHC難以判斷dystrophin蛋白缺失，進(jìn)一步行WB檢測(cè)dystrophin蛋白，明確診斷。3、

6、多條帶WB篩選疑診LGMD，明確診斷。4、分析dystrophinopathy和LGMD臨床特點(diǎn)及鑒別。
　　 [方法]病例來(lái)自在北京協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)病理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行肌肉活檢的患者。第一部分根據(jù)患者的臨床特點(diǎn)和肌肉病理改變，篩選37例疑似dystrophinopathy病例的肌肉標(biāo)本IHC檢測(cè)dystrophin蛋白(dys-R、dys-N、dys-C三種抗體)，其中25例還選用IHC檢測(cè)α-sarcoglycan、β-sarcogl

7、ycan、caveolin3蛋白；對(duì)于36例病例(1例未提取足量蛋白)進(jìn)行WB檢測(cè)dystrophin蛋白、dysferlin蛋白；收集病例的病史及臨床資料；第二部分篩選30例疑似LGMD病例的肌肉標(biāo)本，IHC檢測(cè)α-sarcoglycan、β-sarcoglycan、caveolin3蛋白；對(duì)于其中26例進(jìn)行多條帶WB檢測(cè)dystrophin、dysferlin、calpain3及caveolin3蛋白。同時(shí)收集病例的病史、臨床資料。

8、
　　 [結(jié)果]在第一部分37例疑診dystrophinopathies病例中，4例肌纖維膜單一抗體無(wú)表達(dá)，其余33例肌纖維膜三種抗體有不同程度免疫反應(yīng)，10例伴有其他蛋白表達(dá)異常；36例WB發(fā)現(xiàn)條帶無(wú)表達(dá)、條帶分子量異常、條帶強(qiáng)度減弱、單一抗體無(wú)反應(yīng)及條帶正常，其中4例伴有dysferlin表達(dá)異常。綜合病例的臨床表現(xiàn)、肌肉病理檢查、IHC和WB分析，診斷dystrophinopathies32例，其臨床表型多樣。
　　

9、 在第二部分30例疑似LGMD病例中，1例肌纖維膜上β-sarcoglycan免疫反應(yīng)輕度減弱。1例α-sarcoglycan和caveolin3輕度減弱。26例行多條帶WB發(fā)現(xiàn)dysferlin蛋白條帶無(wú)表達(dá)或強(qiáng)度減弱9例，calpain3蛋白條帶強(qiáng)度減弱或無(wú)表達(dá)1例，11例多條帶均正常，1例dystrophin蛋白條帶強(qiáng)度減弱，1例dystrophin蛋白條帶可疑雙帶，且條帶強(qiáng)度減弱，其余病例伴有至少2種不同抗體條帶強(qiáng)度減弱。診斷

10、dysferlinopathies9例，LGMD2A1例。
　　 [結(jié)論]
　　 第一部分的研究結(jié)論：
　　 1、IHC與WB在檢測(cè)dystrophin蛋白中的關(guān)系:1)IHC顯示嚴(yán)重缺失、單一抗體缺失:WB與IHC結(jié)果具有一致性，今后此類(lèi)病例可單做IHC；2)IHC顯示輕度缺失:需要進(jìn)一步行WB檢測(cè)dystrophin蛋白；3)臨床高度疑診、IHC顯示正常:需要進(jìn)一步行WB檢測(cè)dystrophin蛋白。2、dy

11、strophinopathy臨床特點(diǎn)、鑒別診斷:1)成人發(fā)病的BMD與LGMD從臨床很難鑒別，需進(jìn)一步行dystrophin蛋白檢測(cè)；2)臨床無(wú)癥狀或癥狀輕微、肌酶明顯增高、腓腸肌肥大，需進(jìn)一步行dystrophin蛋白檢測(cè)；3)心肌病伴有肌酶明顯增高，需進(jìn)一步行dystrophin蛋白檢測(cè)。3、dystrophin蛋白-基因-臨床分型具有一定相關(guān)性，但是還有很多的異質(zhì)性。
　　 第二部分的研究結(jié)論：
　　 1、LGMD