免疫組織化學(xué)技術(shù)在雞三種病毒性腫瘤病鑒別診斷中的應(yīng)用.pdf

1、近幾年來，隨著飼養(yǎng)規(guī)模的擴(kuò)大，禽白血病、馬立克氏病和網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥等腫瘤病的發(fā)病率越來越高，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并且以前的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，臨床上三種腫瘤病的混合感染非常普遍，從而導(dǎo)致通過臨床癥狀對這三種腫瘤病進(jìn)行鑒別診斷非常困難，容易出現(xiàn)誤診。另外，目前該三種腫瘤病的實驗室檢測方法也存在許多不足之處。本研究結(jié)合免疫組織化學(xué)檢測方法具有快速、特異性好、可鑒別診斷等優(yōu)點，利用實驗室保存的J亞群禽白血病病毒HN0001株、馬立克

2、氏病毒GX0101株和網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒SNV株分別攻毒1日齡SPF雞，取攻毒后雞的臟器，利用針對這三種病毒的單抗，分別建立這三種疾病的免疫組織化學(xué)檢測方法；并且通過三種病毒共感染1日齡SPF雞，對感染后不同周齡雞的肝臟、腎臟和法氏囊等臟器進(jìn)行HE染色和病理學(xué)觀察，了解三種病毒共感染1日齡SPF雞后不同臟器的動態(tài)病理學(xué)變化；同時通過免疫組化檢測不同臟器內(nèi)的病毒，研究三種病毒在不同臟器組織細(xì)胞內(nèi)的動態(tài)分布，以及利用連續(xù)切片對病毒感染進(jìn)

3、行細(xì)胞定位，在同一視野下觀察三種病毒是否能夠感染同一個組織細(xì)胞。最后本研究利用建立的免疫組織化學(xué)方法，和特異性強(qiáng)的傳統(tǒng)的病毒分離方法對來自北京、山東和河南部分養(yǎng)雞場的腫瘤病死雞進(jìn)行了這三種病毒感染的調(diào)查，比較了兩種檢測方法在雞腫瘤病診斷中的優(yōu)缺點。
　　 ⑴J亞群禽白血病、馬立克氏病和網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥免疫組織化學(xué)檢測方法的建立：①J亞群禽白血病免疫組織化學(xué)檢測方法的建立J 亞群禽白血病病毒HN0001 株腹腔攻毒1日齡SPF雞

4、，從攻毒后第4周雞只開始出現(xiàn)死亡，通過利用該病毒傳統(tǒng)的實驗室診斷技術(shù)IFA實驗驗證了HN0001成功感染雞只。同時取病死雞的不同臟器制作石蠟切片后，通過對免疫組化的關(guān)鍵步驟：抗原修復(fù)時間和方式、過氧化氫消化時間、一抗稀釋比例、DAB 顯色時間等條件的優(yōu)化，成功建立了ALV-J 免疫組織化學(xué)檢測方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗原修復(fù)采用檸檬酸鹽緩沖液中92-98℃加熱15min；過氧化氫消化為室溫消化20-30min；DAB顯色時間為室溫下10min。A

5、LV-J 單克隆抗體JE9 稀釋比例為1:150，檢測到的陽性染色主要出現(xiàn)在肝臟和法氏囊的胞核和胞漿中、脾臟的胞漿和腎臟的胞膜、胞漿中。②雞馬立克氏病免疫組織化學(xué)檢測方法的建立馬立克氏病病毒GX0101株腹腔攻毒1日齡SPF雞，從攻毒后第5周開始出現(xiàn)死亡，也利用IFA實驗驗證了GX0101成功感染雞只。通過對抗原修復(fù)時間和方式、過氧化氫消化時間、一抗稀釋比例、顯色時間等條件的優(yōu)化，成功建立了MDV免疫組織化學(xué)染色方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MDV 單

6、克隆抗體H19 稀釋比例為1:150，其它條件與ALV-J的方法一致；同時檢測到陽性染色主要出現(xiàn)在肝臟、腎臟和法氏囊的胞核和胞漿、脾臟的胞漿中。③雞網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥免疫組織化學(xué)檢測方法的建立網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒SNV 株腹腔攻毒1日齡SPF雞，從攻毒后第4周開始出現(xiàn)死亡，也通過病毒分離實驗驗證了SNV 株成功感染雞只。同時也通過對抗原修復(fù)時間和方式、過氧化氫消化時間、一抗稀釋比例、顯色時間等條件的優(yōu)化，成功建立了該病免疫組織化學(xué)染色

7、方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)REV 單克隆抗體11B118 稀釋比例為1:300，同樣其他條件也與ALV-J的相同。可以從肝臟、腎臟、脾臟和法氏囊組織細(xì)胞的胞漿中觀察到陽性染色。
　　 ⑵三種腫瘤病毒共感染SPF雞的動態(tài)病理學(xué)觀察本研究。利用HN0001、GX0101和SNV株共感染1日齡SPF雞，取感染后不同周齡雞的臟器制作石蠟切片進(jìn)行HE染色，了解三種病毒混合感染引起的雞只不同臟器的動態(tài)病理學(xué)變化，同時利用建立的免疫組織化學(xué)方法研究三種病

8、毒共感染雞后在不同臟器組織細(xì)胞內(nèi)的動態(tài)分布以及利用連續(xù)切片在同一視野下觀察三種病毒能否感染同一組織細(xì)胞。三種病毒共感染1日齡SPF雞后，每周剖殺3只雞，取自然死亡和剖殺雞只的肝臟、法氏囊和腎臟，制作石蠟切片，進(jìn)行HE染色，觀察其病理學(xué)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：肝臟：攻毒早期（1-42天），肝細(xì)胞索并未消失，中期（42-120天）部分肝細(xì)胞索消失，到了攻毒晚期（120-180天），肝細(xì)胞索基本全部消失。淋巴細(xì)胞浸潤生長。隨著肝細(xì)胞索的消失，肝臟上皮

9、細(xì)胞胞核也發(fā)生溶解；腎臟：攻毒早期（1-42天），腎小管上皮細(xì)胞萎縮，中期（42-120天）部分腎小管上皮細(xì)胞消失，到了攻毒晚期（120-180天），大量上皮細(xì)胞發(fā)生崩解。法氏囊：攻毒后早期（1-42天）和中期（42-120天），法氏囊濾泡未消失，濾泡髓質(zhì)細(xì)胞部分發(fā)生崩解，攻毒晚期（120-180天），法氏囊濾泡結(jié)構(gòu)模糊，法氏囊濾泡髓質(zhì)細(xì)胞幾乎全部崩解。同時利用免疫組化方法檢測三種病毒在感染后不同周齡雞的臟器內(nèi)分布發(fā)現(xiàn)，REV在感染后第

10、7天首先在法氏囊被檢測到；MDV和ALV-J在攻毒后第14天可以被檢測到。對三種病毒在不同臟器內(nèi)的動態(tài)分布研究發(fā)現(xiàn)：ALV-J陽性信號最早出現(xiàn)在肝臟中，隨著感染日齡的增大，肝臟內(nèi)陽性細(xì)胞的數(shù)量和陽性染色的深淺并沒有發(fā)生顯著變化，而法氏囊組織細(xì)胞內(nèi)，隨著日齡增大陽性細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，染色也加深，腎臟中卻是陽性細(xì)胞的數(shù)量變化不大，但是陽性染色隨著感染日齡的增大而加深；REV陽性信號最早是出現(xiàn)在法氏囊中，并且隨著感染日齡的增加，肝臟和法氏囊濾

11、泡細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的陽性細(xì)胞數(shù)量發(fā)生一過性增多又降低，染色也是先加深又變淺，腎臟中陽性細(xì)胞數(shù)量和陽性染色隨著感染日齡的增大而增加；MDV陽性信號與REV的一樣，最早也是出現(xiàn)在法氏囊中，但是法氏囊濾泡細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞和肝臟內(nèi)陽性細(xì)胞的數(shù)量隨著感染日齡增加而增多，陽性染色深淺變化不大，而在腎臟中一直未發(fā)現(xiàn)陽性細(xì)胞。并且，陽性染色在細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)的部位與單獨感染時一致。利用連續(xù)組織切片，對三種病毒進(jìn)行同視野觀察發(fā)現(xiàn)，三種病毒共感染雞后，可以共同感染

12、脾臟和法氏囊的同一個組織細(xì)胞，還未發(fā)現(xiàn)可以感染肝臟和腎臟的同一組織細(xì)胞；而三種病毒可以感染同一只雞的肝臟、脾臟和法氏囊，不能感染同一只雞的腎臟，REV和ALV-J可以感染同一只雞的肝臟、脾臟、腎臟和法氏囊組織。
　　 ⑶中國部分地區(qū)腫瘤病死雞三種腫瘤病毒的感染情況調(diào)查。本實驗收集了來自我國北京、山東和河南部分地區(qū)腫瘤病死雞91只，利用特異性較強(qiáng)的IFA和免疫組化方法檢測了J亞群禽白血病、馬立克氏病和網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥的感染情況，

13、比較了兩種檢測方法的優(yōu)缺點。調(diào)查結(jié)果表明，腫瘤病死雞中ALV-J的單獨檢出率最高，尤以北京地區(qū)最高，而MDV單獨檢出率則相對較低，REV位于兩者之間，說明目前危害家禽的腫瘤病仍然是以J亞群禽白血病為主；同時發(fā)現(xiàn)，三種病毒的混合感染也是較為普遍的，其中ALV-J和REV的混合感染最為普遍，其次是MDV和REV，混合感染率較低的是MDV和ALV-J。免疫組化檢測方法不僅可以觀察臟器的病理學(xué)變化，而且還可以利用不同的單抗對三種疾病進(jìn)行鑒別診斷