系統(tǒng)性紅斑狼瘡CD4+T細(xì)胞組蛋白修飾異常及SIRT1-siRNA對(duì)MRL-lpr-lpr狼瘡鼠模型干預(yù)的研究.pdf

1、本文就系統(tǒng)性紅斑狼瘡CD4+T細(xì)胞組蛋白修飾異常及SIRT1-siRNA對(duì)MRL-lpr/lpr狼瘡鼠模型干預(yù)的研究進(jìn)行了論述，主要分以下幾個(gè)方面： 第一部分狼瘡T細(xì)胞組蛋白修飾異常的研究 第一節(jié)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者CD4+T細(xì)胞組蛋白修飾異常的研究 目的：表觀遺傳學(xué)機(jī)制在人類(lèi)疾病包括腫瘤、衰老和自身免疫病中扮演著重要角色。DNA甲基化，組蛋白修飾是表觀遺傳學(xué)修飾的主要方式，在基因調(diào)控中起重要作用。前期的研究發(fā)現(xiàn)系

2、統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者T細(xì)胞中基因組DNA及與自身免疫相關(guān)基因存在不同程度的低甲基化，本研究主要探討SLE患者CD4+T細(xì)胞中核心組蛋白H3/H4乙?；虷3K4/H3K9甲基化狀態(tài)，組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(HATs)、組蛋白去乙?；?HDACs)及組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(HMTs)表達(dá)水平以及對(duì)組蛋白乙?；图谆癄顟B(tài)的影響。 方法：20例系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者均來(lái)自我院門(mén)診，活動(dòng)性患者10例，其中男1例，女9例，年齡14～41歲，平

3、均年齡27.6±10.4歲，平均SLEDAI評(píng)分9.8±4.9分，非活動(dòng)性患者10例，其中男2例，女8例，年齡15～58歲，平均年齡29.8±13.8，平均SLEDAI評(píng)分1.0±1.7分。正常對(duì)照組10例，男4例，女6例，年齡22～35歲，平均28.5±5.2歲，均為本院健康醫(yī)務(wù)人員。采用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，免疫磁珠分離外周血CD4+T細(xì)胞，H3/H4乙酰化及H3K4/H3K9甲基化檢測(cè)試劑盒檢測(cè)H3/H4乙?；虷3

4、K4/H3K9甲基化水平，實(shí)時(shí)定量RT-PCR(real-time RT-PCR)法檢測(cè)CD4+T細(xì)胞組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(HATs)-EP300，CREBBP和PCAE，組蛋白去乙?；?HDACs)-HDACl，HDAC2，HDAC4，HDAC5，HDAC7A和SIRT1，組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(HMTs)-SUV39H1、SUV39H2和EZH2基因tuRNA表達(dá)水平。 結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，活動(dòng)性狼瘡患者CD4+T細(xì)胞組蛋白H

5、3/H4均呈低乙酰化狀態(tài)(P=0.002，P=0.009)，且組蛋白H3乙酰化水平與疾病活動(dòng)程度呈負(fù)相關(guān)(R=-0.889，P=0.044)，活動(dòng)性和非活動(dòng)性狼瘡患者CD4+T細(xì)胞H3K9甲基化水平顯著降低(P=0.001，P=0.003)，而H3K4甲基化水平無(wú)明顯改變(P>0.05)。此外，我們發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比，活動(dòng)性SLE患者CD4+T細(xì)胞SIRT1 mRNA表達(dá)水平明顯增高(P<0.001)，而CREBBP，P300，HDA

6、C2，HDAC7，SUV39H2，EZH2 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.001，P<0.001，P=0.01，P<0.001，P=0.003，P=0.001)。非活動(dòng)性SLE患者HDAC2，HDAC7，SUV39H2，EZH2 mRNA表達(dá)水平也顯著降低(P=0.009，P<0.001，P=0.04，P=0.001)。 結(jié)論：CD4+T細(xì)胞組蛋白修飾如核心組蛋白H3/H4低乙酰化和H3K9低甲基化可能在SLE發(fā)病中起重要作

7、用。 第二節(jié) MRL/lpr狼瘡鼠CD4+T細(xì)胞組蛋白修飾酶譜的研究 目的：研究MRL/lpr狼瘡鼠CD4+T細(xì)胞中組蛋白乙?；?HATs)、去乙?；?HDACs)、組蛋白甲基化酶(HATs)表達(dá)是否存在異常? 方法：SPF級(jí)18周齡MRL/lpr狼瘡鼠10只，另10只野生型MRL/MPJ小鼠為正常對(duì)照組，實(shí)時(shí)定量RT-PCR(real-time RT-PCR)法檢測(cè)CD4+T細(xì)胞組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(HATs

8、)-EP300，CREBBP和PCAF,組蛋白去乙?；?HDACs)-HDAC1，HDAC2，HDAC4，HDAC5，HDAC7和SIRT1，組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(HMTs)-SUV39H1、SUV39H2和EZH2基因mRNA表達(dá)水平，Western印跡檢測(cè)SIRT1蛋白表達(dá)。 結(jié)果：與野生型MRL/MPJ小鼠相比，MRL-lpr/lpr狼瘡鼠CD4+T細(xì)胞P300，PCAF,HDAC7，SUV39H2和EZH2 mRNA顯著降

9、低(P=0.04，P=0.04，P=0.04，P=0.03，P=0.01)，SIRT1 mRNA表達(dá)顯著增高(P=0.04)。Westem印記結(jié)果顯示，MRL-lpr/lpr狼瘡鼠CD4+T細(xì)胞SIRT1蛋白表達(dá)顯著增高(P=0.01)，這些結(jié)果與系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者CD4+T細(xì)胞組蛋白修飾異常大體一致。 結(jié)論：狼瘡鼠模型CD4+T細(xì)胞存在組蛋白乙?；图谆揎棶惓?。 第二部分SIRT1-siRNA對(duì)MRL/lpr狼瘡鼠

10、模型組蛋白修飾異常的干預(yù)及其治療作用 目的：探討SIRT1-siRNA對(duì)MRL/lpr狼瘡鼠模型組蛋白修飾異常的干預(yù)及其治療作用。 方法：SPF級(jí)18周齡雌性MRL/lpr小鼠，密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，用免疫磁珠分離外周血CD4+T細(xì)胞，小鼠分成四組，每組3只進(jìn)行動(dòng)物模型試驗(yàn)，①M(fèi)RL/lpr小鼠+SIRT1-siRNA注射組；②MRL/lpr小鼠+Control-siRNA注射組；③MRL/lpr+生理鹽水

11、注射組；④MRL/lpr小鼠未處理組。每50ug化學(xué)合成siRNA溶解于1ml PBS中，注射至小鼠尾靜脈中，8h和24h重復(fù)注射一次。所有注射均采用鼠尾靜脈流體力學(xué)轉(zhuǎn)染技術(shù)。24h、5d、10d后采集各組小鼠外周血分離CD4+T細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)定量PCR及Western blot技術(shù)檢測(cè)SIRT1 mRNA及蛋白水平，EpigentekTM試劑盒檢測(cè)組蛋白H3、H4乙?；剑嘎?lián)免疫吸附法(ELISA)法檢測(cè)抗dsDNA抗體和抗核抗體

12、(ANA)，用尿蛋白試紙法檢測(cè)尿蛋白水平，采用直接免疫熒光法及HE染色病理切片檢測(cè)小鼠腎臟損害情況。 結(jié)果： 1)與空白對(duì)照組比較，SIRT1-siRNA轉(zhuǎn)染24h后小鼠CD4+T細(xì)胞SIRT1 mRNA及蛋白表達(dá)水平下降(P=0.04，P=0.001)，5天后恢復(fù)基礎(chǔ)水平。 2)SIRT1-siRNA干預(yù)后24h組蛋白H3、H4乙?；斤@著增高(P=0.02，P=0.01)，并一直持續(xù)到第5天(P=0.04，

13、P=0.04)，干預(yù)后第10天組蛋白H4乙?；饺暂^空白組顯著增高(P=0.001)。 3)SIRT1-siRNA干預(yù)后第10天抗dsDNA抗體水平明顯降低(P=0.04)，抗核抗體(ANA)無(wú)明顯改變(P>0.05)。 4)腎臟HE染色組織病理及免疫熒光結(jié)果顯示SIRT1-siRNA干預(yù)后10天腎小管及血管病變均明顯好轉(zhuǎn)。同時(shí)，尿蛋白結(jié)果也較前好轉(zhuǎn)。 5)與空白對(duì)照組比較，Control-siRNA組及生理鹽