系統(tǒng)性紅斑狼瘡CD4+T細胞組蛋白修飾異常及SIRT1-siRNA對MRL-lpr-lpr狼瘡鼠模型干預的研究.pdf

1、本文就系統(tǒng)性紅斑狼瘡CD4+T細胞組蛋白修飾異常及SIRT1-siRNA對MRL-lpr/lpr狼瘡鼠模型干預的研究進行了論述，主要分以下幾個方面： 第一部分狼瘡T細胞組蛋白修飾異常的研究 第一節(jié)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者CD4+T細胞組蛋白修飾異常的研究 目的：表觀遺傳學機制在人類疾病包括腫瘤、衰老和自身免疫病中扮演著重要角色。DNA甲基化，組蛋白修飾是表觀遺傳學修飾的主要方式，在基因調(diào)控中起重要作用。前期的研究發(fā)現(xiàn)系

2、統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者T細胞中基因組DNA及與自身免疫相關(guān)基因存在不同程度的低甲基化，本研究主要探討SLE患者CD4+T細胞中核心組蛋白H3/H4乙?；虷3K4/H3K9甲基化狀態(tài)，組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(HATs)、組蛋白去乙?；?HDACs)及組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(HMTs)表達水平以及對組蛋白乙?；图谆癄顟B(tài)的影響。 方法：20例系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者均來自我院門診，活動性患者10例，其中男1例，女9例，年齡14～41歲，平

3、均年齡27.6±10.4歲，平均SLEDAI評分9.8±4.9分，非活動性患者10例，其中男2例，女8例，年齡15～58歲，平均年齡29.8±13.8，平均SLEDAI評分1.0±1.7分。正常對照組10例，男4例，女6例，年齡22～35歲，平均28.5±5.2歲，均為本院健康醫(yī)務人員。采用密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，免疫磁珠分離外周血CD4+T細胞，H3/H4乙?；癏3K4/H3K9甲基化檢測試劑盒檢測H3/H4乙?；虷3

4、K4/H3K9甲基化水平，實時定量RT-PCR(real-time RT-PCR)法檢測CD4+T細胞組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(HATs)-EP300，CREBBP和PCAE，組蛋白去乙?；?HDACs)-HDACl，HDAC2，HDAC4，HDAC5，HDAC7A和SIRT1，組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(HMTs)-SUV39H1、SUV39H2和EZH2基因tuRNA表達水平。 結(jié)果：與正常對照組比較，活動性狼瘡患者CD4+T細胞組蛋白H

5、3/H4均呈低乙?；癄顟B(tài)(P=0.002，P=0.009)，且組蛋白H3乙酰化水平與疾病活動程度呈負相關(guān)(R=-0.889，P=0.044)，活動性和非活動性狼瘡患者CD4+T細胞H3K9甲基化水平顯著降低(P=0.001，P=0.003)，而H3K4甲基化水平無明顯改變(P>0.05)。此外，我們發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，活動性SLE患者CD4+T細胞SIRT1 mRNA表達水平明顯增高(P<0.001)，而CREBBP，P300，HDA

6、C2，HDAC7，SUV39H2，EZH2 mRNA表達水平顯著降低(P<0.001，P<0.001，P=0.01，P<0.001，P=0.003，P=0.001)。非活動性SLE患者HDAC2，HDAC7，SUV39H2，EZH2 mRNA表達水平也顯著降低(P=0.009，P<0.001，P=0.04，P=0.001)。 結(jié)論：CD4+T細胞組蛋白修飾如核心組蛋白H3/H4低乙酰化和H3K9低甲基化可能在SLE發(fā)病中起重要作

7、用。 第二節(jié) MRL/lpr狼瘡鼠CD4+T細胞組蛋白修飾酶譜的研究 目的：研究MRL/lpr狼瘡鼠CD4+T細胞中組蛋白乙?；?HATs)、去乙酰化酶(HDACs)、組蛋白甲基化酶(HATs)表達是否存在異常? 方法：SPF級18周齡MRL/lpr狼瘡鼠10只，另10只野生型MRL/MPJ小鼠為正常對照組，實時定量RT-PCR(real-time RT-PCR)法檢測CD4+T細胞組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(HATs

8、)-EP300，CREBBP和PCAF,組蛋白去乙?；?HDACs)-HDAC1，HDAC2，HDAC4，HDAC5，HDAC7和SIRT1，組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(HMTs)-SUV39H1、SUV39H2和EZH2基因mRNA表達水平，Western印跡檢測SIRT1蛋白表達。 結(jié)果：與野生型MRL/MPJ小鼠相比，MRL-lpr/lpr狼瘡鼠CD4+T細胞P300，PCAF,HDAC7，SUV39H2和EZH2 mRNA顯著降

9、低(P=0.04，P=0.04，P=0.04，P=0.03，P=0.01)，SIRT1 mRNA表達顯著增高(P=0.04)。Westem印記結(jié)果顯示，MRL-lpr/lpr狼瘡鼠CD4+T細胞SIRT1蛋白表達顯著增高(P=0.01)，這些結(jié)果與系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者CD4+T細胞組蛋白修飾異常大體一致。 結(jié)論：狼瘡鼠模型CD4+T細胞存在組蛋白乙?；图谆揎棶惓！?第二部分SIRT1-siRNA對MRL/lpr狼瘡鼠

10、模型組蛋白修飾異常的干預及其治療作用 目的：探討SIRT1-siRNA對MRL/lpr狼瘡鼠模型組蛋白修飾異常的干預及其治療作用。 方法：SPF級18周齡雌性MRL/lpr小鼠，密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，用免疫磁珠分離外周血CD4+T細胞，小鼠分成四組，每組3只進行動物模型試驗，①MRL/lpr小鼠+SIRT1-siRNA注射組；②MRL/lpr小鼠+Control-siRNA注射組；③MRL/lpr+生理鹽水

11、注射組；④MRL/lpr小鼠未處理組。每50ug化學合成siRNA溶解于1ml PBS中，注射至小鼠尾靜脈中，8h和24h重復注射一次。所有注射均采用鼠尾靜脈流體力學轉(zhuǎn)染技術(shù)。24h、5d、10d后采集各組小鼠外周血分離CD4+T細胞，采用實時定量PCR及Western blot技術(shù)檢測SIRT1 mRNA及蛋白水平，EpigentekTM試劑盒檢測組蛋白H3、H4乙?；?，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)法檢測抗dsDNA抗體和抗核抗體

12、(ANA)，用尿蛋白試紙法檢測尿蛋白水平，采用直接免疫熒光法及HE染色病理切片檢測小鼠腎臟損害情況。 結(jié)果： 1)與空白對照組比較，SIRT1-siRNA轉(zhuǎn)染24h后小鼠CD4+T細胞SIRT1 mRNA及蛋白表達水平下降(P=0.04，P=0.001)，5天后恢復基礎水平。 2)SIRT1-siRNA干預后24h組蛋白H3、H4乙?；斤@著增高(P=0.02，P=0.01)，并一直持續(xù)到第5天(P=0.04，

13、P=0.04)，干預后第10天組蛋白H4乙?；饺暂^空白組顯著增高(P=0.001)。 3)SIRT1-siRNA干預后第10天抗dsDNA抗體水平明顯降低(P=0.04)，抗核抗體(ANA)無明顯改變(P>0.05)。 4)腎臟HE染色組織病理及免疫熒光結(jié)果顯示SIRT1-siRNA干預后10天腎小管及血管病變均明顯好轉(zhuǎn)。同時，尿蛋白結(jié)果也較前好轉(zhuǎn)。 5)與空白對照組比較，Control-siRNA組及生理鹽