CD4+T細(xì)胞組蛋白甲基化修飾異常下調(diào)HPK1的表達(dá)及其在系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病中的作用.pdf

1、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種累及多器官、多系統(tǒng)的自身免疫性疾病。其特征為T細(xì)胞過度活化，針對各種自身抗原產(chǎn)生大量的自身抗體。雖然SLE產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)的分子機(jī)制仍不清楚，但近年來越來越多的證據(jù)表明某些免疫相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制改變在SLE的發(fā)生和發(fā)展中起到至關(guān)重要的作用。
　　 “表觀遺傳學(xué)”是指DNA序列不發(fā)生變化的穩(wěn)定且可遺傳的基因表達(dá)改變。其機(jī)制主要涉

2、及DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑和非編碼RNA的調(diào)控等。目前關(guān)于SLE的表觀遺傳學(xué)研究多集中于DNA甲基化上，而關(guān)于組蛋白修飾，特別是特定基因調(diào)控序列上的組蛋白修飾在SLE發(fā)病機(jī)制中的作用研究非常有限。已知組蛋白修飾中，H3K27me3是基因沉默的標(biāo)志，而H3K27me3的水平由組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2和組蛋白去甲基化酶JMJD3共同調(diào)控。
　　 定向造血干細(xì)胞激酶1(Hematopoietic progenitor ki

3、nase1，HPK1)是一種哺乳動(dòng)物Ste20相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于生發(fā)中心激酶(GCK)家族，它能負(fù)調(diào)控TCR信號和T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。本課題組前期研究利用染色質(zhì)免疫沉淀微陣列技術(shù)(ChIP-on-chip)比較了5例正常對照和5例SLE患者CD4+T細(xì)胞基因啟動(dòng)子區(qū)域H3K27me3的差異，發(fā)現(xiàn)SLE患者CD4+T細(xì)胞HPK1啟動(dòng)子區(qū)H3K27me3水平顯著高于健康人CD4+T細(xì)胞。如前所述，H3K27me3能抑制基因

4、轉(zhuǎn)錄，因此，我們推測SLE患者CD4+T細(xì)胞HPK1啟動(dòng)子區(qū)H3K27me3水平可能較高，從而抑制了HPK1的表達(dá)。而HPK1又是TCR信號和T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的負(fù)調(diào)控子。由此，我們提出SLE的發(fā)病機(jī)理之一可能為:CD4+T細(xì)胞HPK1啟動(dòng)子區(qū)H3K27的甲基化酶表達(dá)過度或去甲基化酶表達(dá)減少→H3K27me3水平升高→HPK1表達(dá)受抑→T細(xì)胞過度活化→自身免疫反應(yīng)→SLE。這一假定的發(fā)病機(jī)理將通過兩個(gè)部分的研究來證實(shí)。第一部分，研究H

5、PK1在SLE發(fā)病機(jī)理中的作用:(1)檢測正常對照和SLE患者的CD4+T細(xì)胞中的HPK1表達(dá)水平;(2)在正常對照的CD4+T細(xì)胞中抑制HPK1的表達(dá)，在SLE患者的CD4+T細(xì)胞中過表達(dá)HPK1，檢測對細(xì)胞增殖、IFNγ和IgG產(chǎn)量的影響。第二部分，研究SLE CD4+T細(xì)胞HPK1表達(dá)下調(diào)的組蛋白甲基化修飾異常機(jī)制:(1)檢測正常對照和SLE患者的CD4+T細(xì)胞中HPK1啟動(dòng)子區(qū)H3K27me3的水平;(2)檢測正常對照和SLE患

6、者的CD4+T細(xì)胞中HPK1啟動(dòng)子區(qū)EZH2和JMJD3的水平;(3)在正常對照和SLE患者的CD4+T細(xì)胞中反向調(diào)節(jié)HPK1啟動(dòng)子區(qū)EZH2或/和JMJD3的水平，檢測對HPK1表達(dá)水平的影響。通過這些研究揭示HPK1在SLE發(fā)生、發(fā)展中所發(fā)揮的作用及其異常的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，為SLE的治療尋找新的有效途徑提供理論依據(jù)。
　　 第一部分SLE患者CD4+T細(xì)胞HPK1的表達(dá)及其在自身免疫反應(yīng)中的作用
　　 第一節(jié) SL

7、E患者CD4+T細(xì)胞HPK1的表達(dá)
　　 目的:研究SLE患者CD4+T細(xì)胞中的HPK1表達(dá)改變及其與疾病狀態(tài)的關(guān)系。
　　 方法:采用密度梯度離心法分離15例正常對照和15例SLE患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞，免疫磁珠分選CD4+T細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量一步法RT-PCR檢測HPK1的mRNA水平，Western blotting檢測HPK1的蛋白水平。
　　 結(jié)果:與正常對照比較，SLE患者CD4+T細(xì)胞HPK1 mRNA

8、水平顯著降低(P=0.002);未治療和已治療的SLE患者CD4+T細(xì)胞HPK1 mRNA水平均較正常對照組顯著降低(P=0.002; P=0.004);而未治療的與已治療的SLE患者之間HPK1 mRNA表達(dá)水平無明顯差異(P=0.482); SLE患者CD4+T細(xì)胞HPK1 mRNA水平和SLE疾病活動(dòng)指數(shù)(SLEDAI)呈顯著負(fù)相關(guān)(R=-0.731，P=0.002)。SLE患者CD4+T細(xì)胞HPK1蛋白水平亦顯著降低(P＜0.0

9、01);未治療和已治療的SLE患者CD4+T細(xì)胞HPK1蛋白水平均較正常對照組顯著降低(P＜0.001;P＜0.001);而未治療的與已治療的SLE患者之間HPK1蛋白表達(dá)水平無明顯差異(P=0.712)。
　　 結(jié)論:SLE患者CD4+T細(xì)胞HPK1表達(dá)水平顯著降低，且與疾病活動(dòng)程度負(fù)相關(guān)，提示HPK1與SLE的發(fā)病有關(guān)。
　　 第二節(jié)下調(diào)HPK1表達(dá)誘導(dǎo)正常CD4+T細(xì)胞自身免疫反應(yīng)
　　 目的:探討抑制HP

10、K1表達(dá)能否誘導(dǎo)正常CD4+T細(xì)胞自身免疫反應(yīng)。
　　 方法:采用密度梯度離心法分離3個(gè)正常人的外周血單個(gè)核細(xì)胞，免疫磁珠分選CD4+T細(xì)胞和CD19+B細(xì)胞，設(shè)計(jì)針對HPK1的siRNA和對照siRNA，電穿孔法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染正常人的CD4+T細(xì)胞，采用Westernblotting檢測HPK1蛋白表達(dá)水平，MTT檢測細(xì)胞增殖活性，ELISA檢測IFNγ和IgG水平。
　　 結(jié)果:轉(zhuǎn)染HPK1 siRNA后，正常人的CD4+

11、T細(xì)胞HPK1蛋白水平明顯降低(P=0.001)，細(xì)胞增殖活性(P=0.012)、IFNγ產(chǎn)量(P=0.008)、刺激自身B細(xì)胞產(chǎn)生IgG抗體量(P=0.005)均顯著上升。
　　 結(jié)論:抑制HPK1的表達(dá)可誘導(dǎo)正常CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)。
　　 第三節(jié) HPK1過表達(dá)抑制SLE患者CD4+T細(xì)胞自身免疫反應(yīng)
　　 目的:探討誘導(dǎo)HPK1過表達(dá)能否糾正或逆轉(zhuǎn)SLE患者CD4+T細(xì)胞的自身反應(yīng)性。
　

12、　 方法:采用密度梯度離心法分離3個(gè)SLE患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞，免疫磁珠分選CD4+T細(xì)胞和CD19+B細(xì)胞，電穿孔法將HPK1表達(dá)質(zhì)粒及對照質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SLE患者的CD4+T細(xì)胞，采用Western blotting檢測HPK1蛋白表達(dá)水平，MTT檢測細(xì)胞增殖活性，ELISA檢測IFNγ和IgG水平。
　　 結(jié)果:轉(zhuǎn)染HPK1表達(dá)質(zhì)粒后，SLE患者CD4+T細(xì)胞HPK1蛋白水平明顯上升(P=0.007)，細(xì)胞增殖活性(P=

13、0.009)、IFNγ產(chǎn)量(P=0.005)、刺激自身B細(xì)胞產(chǎn)生IgG抗體量(P=0.003)均顯著下降。
　　 結(jié)論:誘導(dǎo)HPK1過表達(dá)可抑制SLE患者CD4+T細(xì)胞的自身免疫反應(yīng)。
　　 第二部分 SLE患者CD4+T細(xì)胞HPK1表達(dá)下調(diào)的組蛋白甲基化修飾異常機(jī)制
　　 第一節(jié) SLE患者CD4+T細(xì)胞HPK1啟動(dòng)子區(qū)H3K27me3的水平
　　 目的:研究SLE患者CD4+T細(xì)胞HPK1啟動(dòng)子區(qū)H3

14、K27me3的水平及其與HPK1表達(dá)的關(guān)系。
　　 方法:采用第一部分第一節(jié)預(yù)留的標(biāo)本，染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)結(jié)合實(shí)時(shí)定量PCR檢測HPK1啟動(dòng)子區(qū)H3K27me3的水平。
　　 結(jié)果:與正常對照相比，SLE患者CD4+T細(xì)胞HPK1啟動(dòng)子區(qū)H3K27me3的水平顯著升高(P＜0.001)，且與HPK1 mRNA水平顯著負(fù)相關(guān)(R=-0.775，P=0.001)。
　　 結(jié)論:SLE患者CD4+T細(xì)胞HPK1

15、啟動(dòng)子區(qū)H3K27me3水平升高，且與HPK1表達(dá)負(fù)相關(guān)，提示SLE患者CD4+T細(xì)胞HPK1表達(dá)下調(diào)可能與其啟動(dòng)子區(qū)H3K27me3水平升高有關(guān)。
　　 第二節(jié) SLE患者CD4+T細(xì)胞HPK1啟動(dòng)子區(qū)EZH2和JMJD3的水平
　　 目的:研究SLE患者CD4+T細(xì)胞HPK1啟動(dòng)子區(qū)EZH2和JMJD3的水平及其與H3K27me3水平和HPK1表達(dá)的關(guān)系。
　　 方法:采用第一部分第一節(jié)預(yù)留的標(biāo)本，ChIP結(jié)

16、合實(shí)時(shí)定量PCR檢測HPK1啟動(dòng)子區(qū)EZH2和JMJD3的水平。
　　 結(jié)果:與正常對照相比，SLE患者CD4+T細(xì)胞HPK1啟動(dòng)子區(qū)JMJD3水平顯著降低(P＜0.001); EZH2水平則無顯著性差異(P=0.223);SLE患者CD4+T細(xì)胞HPK1啟動(dòng)子區(qū)JMJD3水平與H3K27me3顯著負(fù)相關(guān)（R=-0.756，P=0.001），而與HPK1mRNA水平顯著正相關(guān)(R=0.645，P=0.009)。
　　 結(jié)

17、論: SLE患者CD4+T細(xì)胞HPK1啟動(dòng)子區(qū)JMJD3下降導(dǎo)致H3K27me3水平上升可能是HPK1表達(dá)下調(diào)的關(guān)鍵所在。
　　 第三節(jié)下調(diào)正常CD4+T細(xì)胞HPK1啟動(dòng)子區(qū)JMJD3水平對HPK1表達(dá)的影響
　　 目的:探討下調(diào)HPK1啟動(dòng)子區(qū)JMJD3水平對正常CD4+T細(xì)胞HPK1的表達(dá)及其啟動(dòng)子區(qū)H3K27me3水平的影響。
　　 方法:采用密度梯度離心法分離3個(gè)正常人的外周血單個(gè)核細(xì)胞，免疫磁珠分選CD

18、4+T細(xì)胞，設(shè)計(jì)針對JMJD3的siRNA和對照siRNA，電穿孔法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染正常人的CD4+T細(xì)胞，采用Western blotting檢測MJD3和HPK1蛋白表達(dá)水平，ChIP結(jié)合實(shí)時(shí)定量PCR檢測HPK1啟動(dòng)子區(qū)JMJD3和H3K27me3的水平。
　　 結(jié)果:轉(zhuǎn)染JMJD3 siRNA后，正常人的CD4+T細(xì)胞JMJD3和HPK1蛋白水平明顯降低(P=0.002;P=0.002)，HPK1啟動(dòng)子區(qū)JMJD3水平顯著降低(

19、P=0.012)，而H3K27me3水平則顯著上升(P=0.019)。
　　 結(jié)論:在正常CD4+T細(xì)胞中下調(diào)JMJD3水平可導(dǎo)致HPK1水平下降，而這一作用至少部分是通過下調(diào)HPK1啟動(dòng)子區(qū)JMJD3的水平，導(dǎo)致該區(qū)H3K27me3的水平升高而實(shí)現(xiàn)的。
　　 第四節(jié)上調(diào)SLE患者CD4+T細(xì)胞HPK1啟動(dòng)子區(qū)JMJD3水平對HPK1表達(dá)的影響
　　 目的:探討上調(diào)HPK1啟動(dòng)子區(qū)JMJD3水平對SLE患者CD4

20、+T細(xì)胞HPK1的表達(dá)及其啟動(dòng)子區(qū)H3K27me3水平的影響。
　　 方法:采用密度梯度離心法分離3個(gè)SLE患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞，免疫磁珠分選CD4+T細(xì)胞，電穿孔法將JMJD3表達(dá)質(zhì)粒及對照質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SLE患者的CD4+T細(xì)胞，采用Western blotting檢測JMJD3和HPK1蛋白表達(dá)水平，ChIP結(jié)合實(shí)時(shí)定量PCR檢測HPK1啟動(dòng)子區(qū)JMJD3和H3K27me3的水平。
　　 結(jié)果:轉(zhuǎn)染JMJD3表達(dá)質(zhì)