球孢白僵菌降解寄主體壁的幾丁質(zhì)酶和蛋白酶的分子改良.pdf

1、本文為了進(jìn)一步提高殺蟲真菌的防治效果，采用DNAshuffling和結(jié)構(gòu)域融合等技術(shù)對球孢白僵菌降解體壁的幾丁質(zhì)酶(Bbchit1)和蛋白酶(CDEP-1)基因進(jìn)行分子改良。利用DNAshuffling技術(shù)對球孢白僵菌的幾丁質(zhì)酶基因Bbchit1進(jìn)行定向進(jìn)化，獲得了幾丁質(zhì)酶活性提高的突變體；通過對不同來源幾丁質(zhì)結(jié)合域的比較，發(fā)現(xiàn)家蠶幾丁質(zhì)結(jié)合域與幾丁質(zhì)的結(jié)合能力最強。轉(zhuǎn)基因結(jié)果表明，帶有家蠶幾丁質(zhì)結(jié)合域的融合幾丁質(zhì)酶和融合蛋白酶均可以顯

2、著提高球孢白僵菌的毒力。該結(jié)果表明，幾丁質(zhì)結(jié)合域在提高殺蟲真菌的毒力上具有重要作用。主要研究結(jié)果如下： 1.Bbchit1的DNAshuffling。 1.1以大腸桿菌為展示菌DNAshuffling體系的建立。 DNAshuffling中的關(guān)鍵技術(shù)是高效篩選體系的建立。選擇大腸桿菌作為展示菌，根據(jù)菌落在幾丁質(zhì)平板上形成透明圈的大小篩選幾丁質(zhì)酶活性提高的突變體。因此，在大腸桿菌中表達(dá)的Bbchit1必須分泌到胞外

3、并具有生物學(xué)活性。 比較了5種不同來源的信號肽對Bbchit1分泌的影響。結(jié)果表明：1)胡蘿卜歐氏桿菌果膠酶PelB信號肽引導(dǎo)Bbchit1分泌的能力最強；2)低溫有利于Bbchit1在周質(zhì)空間和胞外的累積。在18℃，胞外Bbchit1的產(chǎn)率是37℃的10倍。根據(jù)以上結(jié)果，選用PelB信號肽作為Bbchitlshuffling篩選體系的前導(dǎo)肽，并采用18℃低溫篩選shuffling文庫。 1.2通過DNAshufflin

4、g獲得幾丁質(zhì)酶活性提高的突變體。 經(jīng)過三輪DNAshuffling，篩選了約1.5×105個克隆，最終獲得兩個幾丁質(zhì)酶活性分別提高了36﹪和56﹪的突變體shu-1和shu-2。其中，shu-1突變發(fā)生在V251E，shu-2突變發(fā)生在D71N和A281E。shu-1和shu-2的Km值低于野生型幾丁質(zhì)酶，表明突變的氨基酸影響了幾丁質(zhì)酶與膠體幾丁質(zhì)的親和力；shu-1和shu-2的Vmax/Km值分別是Bbchit1的2.6和3

5、.6倍，說明這兩個突變體對膠體幾丁質(zhì)有較高的利用效率。 將上述兩個突變基因?qū)肭蜴甙捉┚餃y定結(jié)果表明，與組成性表達(dá)野生型Bbchit1的菌株相比，組成性表達(dá)shu-1和shu-2對球孢白僵菌毒力沒有顯著影響。 2.在幾丁質(zhì)酶Bbchit1上添加異源幾丁質(zhì)結(jié)合域提高球孢白僵菌的毒力。 2.1不同來源幾丁質(zhì)結(jié)合域的篩選與分析。 為了分析不同來源幾丁質(zhì)結(jié)合域在結(jié)合幾丁質(zhì)能力上的差異，分別將來自家蠶、苦瓜、

6、環(huán)狀芽孢桿菌、云杉蚜蟲和果蠅的5個幾丁質(zhì)結(jié)合域與球孢白僵菌的幾丁質(zhì)酶基因Bbchit1相融合，獲得了具不同幾丁質(zhì)結(jié)合域的融合幾丁質(zhì)酶。將不同的融合幾丁質(zhì)酶分別轉(zhuǎn)入畢赤酵母進(jìn)行表達(dá)，然后對所得到的融合幾丁質(zhì)酶進(jìn)行結(jié)合分析。結(jié)果表明，具有家蠶幾丁質(zhì)結(jié)合域的融合幾丁質(zhì)酶Bbchit1-Bm與幾丁質(zhì)的結(jié)合能力最強。用標(biāo)記了FITC的幾丁質(zhì)酶進(jìn)行幾丁質(zhì)結(jié)合分析，結(jié)果顯示家蠶幾丁質(zhì)結(jié)合域能使融合幾丁質(zhì)酶大量富集在粉末幾丁質(zhì)的表面，使幾丁質(zhì)上的酶濃度

7、大幅度提高。 2.2融合幾丁質(zhì)酶的酶學(xué)特性分析。 酶動力學(xué)分析表明，融合了家蠶幾丁質(zhì)結(jié)合域的融合幾丁酶Bbchit1-Bm的Km值僅為野生型酶Bbchit1的23﹪，而Vmax/Km值是Bbchit1的3倍。以粉末幾丁質(zhì)為底物，Bbchit1-Bm的酶活性是野生型酶Bbchit1的6.6倍。上述結(jié)果表明，添加家蠶幾丁質(zhì)結(jié)合域提高了幾丁質(zhì)酶對幾丁質(zhì)的親和力，并增強了幾丁質(zhì)酶降解幾丁質(zhì)的效率。但對家蠶幾丁質(zhì)結(jié)合域進(jìn)行突變后，

8、融合幾丁質(zhì)酶與幾丁質(zhì)的結(jié)合特性及酶學(xué)特性均與野生型幾丁質(zhì)酶相比，沒有顯著差異。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，Bbchit1-Bm對蚜蟲體壁的降解能力增強，能在體壁上形成許多小孔。推測其機理是，融合幾丁酶與幾丁質(zhì)結(jié)合能力的提高，導(dǎo)致幾丁質(zhì)酶在昆蟲體壁上得到富集，從而加速了對昆蟲體壁的降解。 2.3組成性表達(dá)融合幾丁酶提高球孢白僵菌的毒力。 將Bbchit1-Bm導(dǎo)入球孢白僵菌組成型表達(dá)，所分析的兩個轉(zhuǎn)化子的半致死時間(LT50)明顯低于B

9、bhit1轉(zhuǎn)化子和野生型菌株。在孢子濃度為107個/mL的條件下，與野生型菌株相比，Bbchit1-Bm菌株的LT50平均降低了25.0﹪，而超量表達(dá)Bbchit1重組菌株的LT50平均只降低了12.8﹪。此外，只超量表達(dá)家蠶幾丁質(zhì)結(jié)合域BmChBD對球孢白僵菌的毒力沒有影響。以上結(jié)果表明，超量表達(dá)添加了家蠶幾丁質(zhì)結(jié)合域的融合幾丁酶基因能在Bbchit1基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高球孢白僵菌的毒力。 3.在類枯草桿菌蛋白酶CDEP-1上添加

10、幾丁質(zhì)結(jié)合域提高球孢白僵菌的毒力。 3.1融合蛋白酶的構(gòu)建及酶學(xué)特性分析。 在上述結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取與幾丁質(zhì)結(jié)合域結(jié)合能力最強的家蠶幾丁質(zhì)結(jié)合域進(jìn)一步與球孢白僵菌類枯草桿菌蛋白酶CDEP-1相融合，獲得了融合蛋白酶CDEP-Bm。將野生型蛋白酶和融合蛋白酶分別轉(zhuǎn)入畢赤酵母進(jìn)行表達(dá)并純化，分析它們的酶學(xué)特性。結(jié)果表明，與野生型蛋白酶相比，融合蛋白酶CDEP-Bm與不溶性幾丁質(zhì)底物的結(jié)合能力提高了1倍；從昆蟲體壁釋放蛋白質(zhì)的

11、能力提高了2.1倍。分別用野生型蛋白酶和融合蛋白酶處理過的昆蟲體壁作為底物，檢測幾丁質(zhì)酶對體壁的降解。結(jié)果表明，從融合蛋白酶CDEP-Bm作用過的昆蟲體壁中檢測到的幾丁質(zhì)酶活性是野生型酶CDEP-1的1.8倍。因此，在蛋白酶CDEP-1上添加家蠶幾丁質(zhì)結(jié)合域提高了蛋白酶與昆蟲體壁的結(jié)合能力，加速了對昆蟲體壁蛋白質(zhì)的降解，暴露出更多的幾丁質(zhì)酶作用位點，從而也提高了幾丁質(zhì)酶分解昆蟲體壁的能力。 3.2在球孢白僵菌分生孢子中添加融合蛋

12、白酶提高其毒力。 將融合蛋白酶作為添加劑與球孢白僵菌野生型菌株Bb0062的分生孢子相混和，以四齡菜青蟲為試蟲，分析其對Bb0062毒力的影響。與未添加蛋白酶的菌株相比，添加野生型酶CDEP-1和融合蛋白酶CDEP-Bm的半致死濃度(LC50)分別降低了48.2﹪和58.9﹪。與添加野生型酶CDEP-1相比，添加融合蛋白酶CDEP-Bm的LC50降低了20.6﹪。半致死時間LT50分析表明(分生孢子濃度107個/mL)，與添加了

13、野生型蛋白酶的菌株相比，添加融合蛋白酶半致死時間降低了20.9﹪。這表明，添加蛋白酶可以提高球孢白僵菌野生型菌株的毒力，而添加具有幾丁質(zhì)結(jié)合域的融合蛋白酶，則可進(jìn)一步提高蛋白酶對野生型菌株的增效作用。 當(dāng)以蚜蟲為試蟲時，添加融合蛋白酶也能在CDEP-1的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高球孢白僵菌的毒力。 3.3組成性表達(dá)融合蛋白酶對球孢白僵菌毒力的影響。 將融合蛋白酶基因?qū)肭蜴甙捉┚勘磉_(dá)。生物測定結(jié)果表明，與野生型菌株相比

14、，CDEP-1-1(組成性表達(dá)野生型蛋白酶基因CDEP-1的球孢白僵菌菌株)和CDEP-Bm-14(組成性表達(dá)融合蛋白酶基因CDEP-Bm的球孢白僵菌菌株)的半致死時間(LT50)分別降低了7.3﹪和14.2﹪。與CDEP-1-1相比，CDEP-Bm-14的LT50降低了7.4﹪。可見，融合蛋白酶基因?qū)s短菌株侵染時間的作用比未改造的蛋白酶基因更強。 添加蛋白酶試驗和轉(zhuǎn)基因試驗結(jié)果均表明，在蛋白酶CDEP-1上添加幾丁質(zhì)結(jié)合域，