核苷(酸)類似物相關(guān)HBV逆轉(zhuǎn)錄酶耐藥突變的焦磷酸測(cè)序及個(gè)體化治療.pdf

1、背景：慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB;慢乙肝）及其肝硬化是嚴(yán)重?fù)p害人類健康的常見傳染病。循證醫(yī)學(xué)資料證明，乙型肝炎病毒( hepatitis B virus， HBV)是疾病進(jìn)展的最重要的因素，故抗病毒治療是慢乙肝治療的關(guān)鍵。目前國際公認(rèn)的兩類有效抗病毒藥物是干擾素（interferon， IFN）和核苷（酸）類似物(nucleos(t)ide analogues， NA)。后者包括拉米夫定(lamivud

2、ine， LAM)、阿德福韋酯（adefovir dipivoxil， ADV）、恩替卡韋(entecavir, ETV)、替比夫定(telbivudine， LdT)及替諾福韋(tenofovir disoproxil， TDF)（前4種已被我國SFDA批準(zhǔn)）。NA具有顯著的抑制HBV復(fù)制的作用；然而肝細(xì)胞中共價(jià)環(huán)狀閉合DNA（cccDNA）的持續(xù)存在，決定了CHB需長(zhǎng)期治療。而隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng)，HBV可能會(huì)發(fā)生NA相關(guān)的耐藥突變，

3、從而可導(dǎo)致肝炎發(fā)作，甚至肝衰竭和死亡，因而NA相關(guān)HBV耐藥突變是一重要的臨床問題。定期監(jiān)測(cè)耐藥、早期發(fā)現(xiàn)耐藥相關(guān)突變并給予有效的挽救治療對(duì)于疾病的控制具有重要意義。
　　 在NA耐藥的監(jiān)測(cè)中，血清HBV DNA是最重要的監(jiān)測(cè)指標(biāo)；但血清HBVDNA水平除受NA耐藥影響外，還與患者依從性、藥物代謝以及體內(nèi)病毒的自然波動(dòng)等因素有關(guān)，因此特異性的NA基因耐藥檢測(cè)是確定NA相關(guān)HBV耐藥突變的必備條件。焦磷酸測(cè)序是一新興的DNA測(cè)序技

4、術(shù)，具有高準(zhǔn)確性和敏感性，當(dāng)變異株超過5％即可檢出，并可定量檢測(cè)多個(gè)耐藥位點(diǎn)，能滿足本研究檢測(cè)HBV P基因區(qū)NA相關(guān)的常見耐藥位點(diǎn)的需要；且檢測(cè)快捷，已有用于LAM、ADV耐藥檢測(cè)的報(bào)道，與直接測(cè)序法的符合率高。
　　 目的：采用焦磷酸測(cè)序法分析HBV P基因區(qū)NA相關(guān)10個(gè)位點(diǎn)的突變情況，探討NA治療前的慢性HBV感染者耐藥突變株的檢出率和突變模式；NA治療過程中出現(xiàn)的相關(guān)HBV耐藥的突變位點(diǎn)、突變模式及相互關(guān)系；病毒學(xué)應(yīng)答

5、不完全的ADV治療患者，HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)耐藥突變的發(fā)生；并對(duì)HBV耐藥突變的患者進(jìn)行個(gè)體化干預(yù)和隨訪觀察。
　　 材料和方法：采用焦磷酸測(cè)序法對(duì)281例慢性HBV感染者的HBV P基因區(qū)10個(gè)位點(diǎn)(rtI169T、rtV173L、rtL180M、rtA181V/T、rtT184G、rtA194T、rtS202I、rtM204V/I、rtN236T、rtM250V)進(jìn)行定量檢測(cè)。據(jù)患者HBV耐藥突變的不同狀態(tài)，進(jìn)行個(gè)體化的干預(yù)治療

6、和隨訪觀察。
　　 結(jié)果：①未經(jīng)核苷（酸）類似物治療的慢性HBV感染者HBV突變株的檢出率為3.66％(3/82)，分別為2例單一rtA181T突變、1例單一rtV173L突變，突變株為非優(yōu)勢(shì)株。②NA治療過程中，LAM相關(guān)耐藥95例，檢出4個(gè)突變位點(diǎn)呈11種模式，以rtM204突變多見；ADV相關(guān)耐藥26例，檢出2個(gè)突變位點(diǎn)呈6種模式，以rtA181V突變?yōu)橹鳎籐AM、ADV相關(guān)耐藥者20例，檢出5個(gè)突變位點(diǎn)呈6種模式，以rt

7、A181T突變最常見；LdT相關(guān)耐藥20例，檢出4個(gè)突變位點(diǎn)呈5種模式，均存在rtM204I突變；ETV相關(guān)耐藥10例，檢出7個(gè)突變位點(diǎn)呈6種模式，以rtT184突變多見。③不同的LAM突變模式間、ADV突變模式間HBV DNA的水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05); LAM耐藥組HBV DNA水平高于ADV耐藥組(P＜0，05)。④ADV治療病毒學(xué)應(yīng)答不完全的28例患者中，25例未檢測(cè)到HBV突變株，3例未檢出病毒。⑤對(duì)LAM、LdT

8、、ETV耐藥者加用ADV，ADV耐藥(N236T)者加用LAM、包含rtA181T位點(diǎn)突變者加／換ETV治療效果好，干擾素對(duì)部分耐藥患者有效。⑥干預(yù)治療后，25％(12/48)患者體內(nèi)的耐藥突變株比率在3月內(nèi)下降，其中6.25％(3/48)突變株消失；治療3月時(shí)，35.42％(17/48)例突變株及其比例同更換治療前；16.67％(8/48)患者體內(nèi)的耐藥突變株會(huì)長(zhǎng)期(≥6個(gè)月)存在；22.92％(11/48)患者體內(nèi)會(huì)出現(xiàn)新的耐藥突變

9、位點(diǎn)。
　　 結(jié)論：①未經(jīng)核苷（酸）類似物治療的慢性HBV感染者體內(nèi)很少存在自然突變株，且為非優(yōu)勢(shì)病毒株。②長(zhǎng)期應(yīng)用核苷（酸）類似物的慢乙肝患者可于HBV P基因區(qū)篩選出核苷（酸）類似物相關(guān)的耐藥突變。LAM相關(guān)突變以rtM204為主，其中rtM204V常伴有rtL180M突變，rtM204I可單獨(dú)存在，rtV173L多出現(xiàn)在rtM204+rtL180M聯(lián)合變異基礎(chǔ)上；ADV相關(guān)突變以rtA181V多見；ETV相關(guān)突變以rtT1

10、84多見，均存在rtM204突變；LdT相關(guān)變異中均存在rtM204I突變。rtA181T與LAM、ADV應(yīng)用有關(guān)。③LAM、ADV耐藥突變模式間HBV DNA水平?jīng)]有差異，LAM耐藥組HBV DNA水平高于ADV耐藥組。④阿德福韋酯治療的慢性HBV感染者，基因型耐藥不是病毒學(xué)應(yīng)答不完全的原因。⑤對(duì)發(fā)生HBV耐藥突變的患者要及時(shí)進(jìn)行個(gè)體化治療，據(jù)HBV耐藥突變位點(diǎn)加／換用無交叉耐藥的藥物或干擾素，并定期檢測(cè)病毒學(xué)應(yīng)答情況。⑥經(jīng)藥物干預(yù)治