慢性乙型肝炎患者HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)新變異rtA181C的鑒定及表型耐藥特點(diǎn)的研究.pdf

1、背景：
　　乙型肝炎病毒（HBV）是危害人民健康的重要疾病。目前，核苷（酸）類似物（NA）是有效控制慢性乙型肝炎病情進(jìn)展的主要臨床用藥，但長(zhǎng)期用藥容易導(dǎo)致藥物作用靶位HBV逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）區(qū)產(chǎn)生耐藥變異，極大地限制了其抗病毒療效。目前研究發(fā)現(xiàn)與核苷（酸）類似物耐藥相關(guān)的變異位點(diǎn)包括拉米夫定為M204V／I、L180M、V173L、A181T、v207I；阿德福韋為N236T、A181V／T；恩替卡韋為M250V+I169T+M20

2、4V+L180M、T184G+S202I+M204V+L180M。除了常見(jiàn)的NA耐藥變異形式，RT區(qū)產(chǎn)生的新變異也值得我們關(guān)注。
　　目的：
　　本研究對(duì)一例NA序貫治療的慢乙肝患者血清HBV逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）區(qū)產(chǎn)生的新變異rtA181C進(jìn)行鑒定并分析其表型特點(diǎn)，為臨床合理制定抗HBV治療方案提供依據(jù)。
　　材料與方法：本研究的血清樣本取自2010年6月解放軍第302醫(yī)院確診的慢性乙型肝炎患者，男43歲，排除其他因素所致

3、肝功能損害。HBV血清學(xué)檢測(cè)顯示：HBsAg、HBeAg、HBcAb均陽(yáng)性。提取患者血清中HBV DNA，巢式PCR擴(kuò)增HBV RT全基因，PCR產(chǎn)物直接雙向測(cè)序結(jié)合克隆測(cè)序分析HBV RT區(qū)12個(gè)耐藥相關(guān)突變位點(diǎn)。構(gòu)建代表性克隆重組表達(dá)載體pTriEx-HBV1.1，提純質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染4h后加入不同濃度拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋和替諾福韋，轉(zhuǎn)染96h后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)不同藥物濃度作用下培養(yǎng)細(xì)胞

4、上清中HBV DNA復(fù)制水平并分析其表型耐藥特點(diǎn)。
　　結(jié)果：
　　此例慢乙肝患者序貫接受拉米夫定治療36個(gè)月→阿德福韋治療14個(gè)月→恩替卡韋治療29個(gè)月，而后發(fā)生病毒突破，HBV DNA由陰性升高到1.1×106IU/mL，轉(zhuǎn)氨酶由正常升高到235 U/L。直接測(cè)序顯示HBV RT基因rtL180M+rtA181V+rtM204V變異，克隆測(cè)序得到18個(gè)克隆，其中9個(gè)為rtL180M+rtA181V+rtM204V變異株，

5、1個(gè)為rtV173L+rtL180M+rtA181V變異株，7個(gè)為rtL180M+rtA181C+rtM204V變異株，1個(gè)為野生株。病毒復(fù)制力檢測(cè)結(jié)果從高到低依次為：野生株>rtV173L+rtL180M+A181V>rtL180M+rtA181C+rtM204V>rtL180M+rtA181V+rtM204V。表型耐藥分析顯示：與野生株比較，rtL180M+rtA181V+rtM204V變異株和rtV173L+rtL180M+rtA