對非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥型HIV-1藥理模型的建立.pdf

1、艾滋病又稱獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)，是由人類免疫缺陷病毒(HIV)所引起的致命性慢性傳染病。HIV主要侵犯、破壞輔助性T淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞免疫功能受損，最后并發(fā)各種嚴(yán)重機(jī)會性感染和腫瘤。 艾滋病目前尚無特效治療方法，早期抗病毒治療是關(guān)鍵。既能緩解病情，減少機(jī)會性感染和腫瘤，又能預(yù)防或延緩AIDS相關(guān)疾病的發(fā)生，延長生存期，提高生活質(zhì)量。根據(jù)HIV生命周期中的主要環(huán)節(jié)，抗HIV藥物分為逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、整合

2、酶抑制劑和融合抑制劑四大類。逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑是最早用于臨床的抗HIV藥物，包括核苷類和非核苷類兩種。其中非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑由于其低毒高效而受到關(guān)注，但由于其抗耐藥屏障作用較弱，使得這類藥物在應(yīng)用一段時間后很容易發(fā)生耐藥。因此，研究和開發(fā)具有抗耐藥作用的新型非核苷類藥物成為發(fā)展方向，而與之相應(yīng)的藥物篩選方法成為關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 目的：在細(xì)胞水平建立三種針對HIV-1復(fù)制環(huán)節(jié)的藥物篩選模型，其對現(xiàn)有的非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTIs

3、)具有特異的耐藥性，可為新型NNRTIs研發(fā)提供篩選平臺。 方法： (1)應(yīng)用PCR法擴(kuò)增含突變位點(diǎn)K103N，K103N/P225H，K103N/G190A的三段目的片段，長度為1.5Kb，介于apaI與AgeI酶切位點(diǎn)間。 (2)用限制性內(nèi)切酶ApaI和Agel分別切割目的片段和HIV-1質(zhì)粒。 (3)T4連接酶將含相同粘末端的目的片段與HIV-1質(zhì)粒進(jìn)行連接，構(gòu)建新的含突變位點(diǎn)的HIV-1質(zhì)粒，分別

4、命名為HIV-K103N、HIV-K103N/P225H、HIV-K103N/G190A。 (4)將HIV-K103N、HIV-K103N/225H、HIV-K103N/G190A分別與水泡性口膜炎病毒的外殼糖蛋白的質(zhì)粒(VSV-G)在293細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染，組裝成假病毒模型，分別命名為VSVG/HIV-K103N、VSVG/HIV-K103M225H、VSVG/HIV-K103N/G190A，模型攜帶的熒光素酶報告基因的表達(dá)水平可

5、以反映HIV-1的復(fù)制程度。 (5)對三種假病毒模型按不同的稀釋比(1:10，1:25，1:50，1:100，1:200和1:400)稀釋后感染293細(xì)胞，用FB15熒光檢測器測定細(xì)胞中熒光素酶的相對活性(RLUs)，并繪制病毒滴度-熒光素酶相對活性曲線。 (6)用核苷類陽性對照藥齊多夫定(AZT)和司他夫定(d4T)；非核苷類陽性對照藥奈韋拉平(NVP)和依非韋倫(EFV)分別對三種假病毒模型進(jìn)行抑制性檢測，并用野生株

6、HIV-1假病毒作對照，驗證模型的可靠性。 結(jié)果： (1)通過PCR成功擴(kuò)增出1.5Kb的目的片段，再通過分子克隆方法構(gòu)建新的HIV-1質(zhì)粒(HIV-K103N、HIV-K103N/P225H、HIV-K103N/G190A)，經(jīng)過DNA測序分析證實突變引入成功。 (2)對假病毒模型滴度檢測證實三種假病毒都具有高度感染能力，VSVG/HIV-K103NT和VSVG/HIV-K103N/P225H按1:10稀釋后感

7、染293細(xì)胞，其RLUs達(dá)到3×107，這也是FB15熒光檢測器的最大檢測值；VSVG/H/V-K103N/G190A按1:10稀釋后感染293細(xì)胞，其RLUs也達(dá)到2×107。病毒滴度-熒光素酶相對活性曲線可以清楚的反應(yīng)出HIV-1復(fù)制水平與熒光素酶報告基因表達(dá)水平間的劑量依賴效應(yīng)。因此，三種假病毒可用于針對HIV-1復(fù)制環(huán)節(jié)的藥物篩選模型。 (3)VSVG/HIV-K103N、VSVG/HIV-K103N/P225H和VSV

8、G/HIV-K103N/G190A以及VSVG/HIV-wild可有效的在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，非核苷類陽性對照藥NVP和EFV可有效抑制VSVG/HIV-wild，其IC50分別為0.024±0.006μmol/L和0.83±0.21nmol/L，與文獻(xiàn)中應(yīng)用其它方法得出的IC50(0.046μmol/L和1.3 nmol/L)基本一致。NVP也可有效抑制 VSVG/HIV-K103N、VSVG/HIV-K103N/P225H和VSVG/H

9、IV-K103N/G190A，但I(xiàn)C50明顯升高，分別為1.89±0.92μmol/L、5.13±0.58μmol/L和27.61±4.796μmol/L，與文獻(xiàn)中應(yīng)用其它方法得出的IC50(2.21μmol/L、6.12μmol/L和23μmol/L)相一致。EFV也可有效抑制VSVG/HIV-K103N、VSVG/HIV-K103N/P225H和VSVG/HIV-K103N/G190A，IC50也明顯升高，分別為16.7±6.0nm

10、ol/L、0.1103±0.0328μmol/L和0.1697±0.1147μmol/L，與文獻(xiàn)中應(yīng)用其它方法得出的IC50(26nmol/L、0.1742μmol/L和0.277μmol/L)相符合。計算三種假病毒對NVP和EFV的耐藥倍數(shù)(耐藥株病毒IC50野生株病毒IC50)，為15～1000倍，說明此三種假病毒模型對NNRTIs產(chǎn)生耐藥性。 (4)核苷類陽性對照藥AZT和d4T可有效抑制VSVG/G/HIV-K103N、

11、VSVG/HIVK103N/P225H和VSVG/HIV-K103N/G190A以及VSVG/HIV-wild，其IC50未有明顯變化，約為9.9±1.4nmol/L和0.153±0.034μmol/L，與文獻(xiàn)中報道的活病毒IC50，以及實驗室應(yīng)用其它方法得出IC50相符合，說明此三種假病毒模型對NRTIs不產(chǎn)生耐藥性。 結(jié)論： HIV-1假病毒模型是針對HIV-1復(fù)制環(huán)節(jié)的細(xì)胞水平藥理篩選模型，其攜帶的熒光報告基因的表