CGRP及其受體亞單位RAMP1對血管平滑肌細胞增殖的調(diào)控作用.pdf

1、目的和背景：
　　 血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)存在于血管中膜，正常情況下能夠合成分泌膠原蛋白并通過輕度收縮以維持血管壁的張力。研究表明VSMCs的異常增殖和遷移在高血壓、動脈粥樣硬化及經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(Percutaneous Coronary Intervention，PCI)術(shù)后血管內(nèi)再狹窄等的病理過程中起著重要作用。新近針對干細胞移植治療的研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細

2、胞(Mesenchymal StemCells，MSCs)的移植有一定的促進損傷動脈內(nèi)皮修復和抑制新生內(nèi)膜增生的作用，但對抑制平滑肌增殖無直接作用。因此，如何通過相關(guān)基因修飾或改造MSCs，使之發(fā)揮最大效應，是下一步的研究需要解決的主要問題。有研究顯示，降鈣素基因相關(guān)肽(Calcitonin Gene-related Peptide，CGRP)與受體結(jié)合，在體內(nèi)外均有抑制VSMCs增殖的作用，并逆轉(zhuǎn)動脈重塑。VSMCs中已被證實有大量的

3、CGRP受體表達，但CGRP并不能單獨與受體結(jié)合，它需要受體活性修飾蛋白(Receptor Activity ModifyingProteins，RAMPs)的介導才能發(fā)揮作用，RAMP1是RAMPs家族中的一種，在VSMCs中檢測到RAMP1受體的表達。本課題組前期實驗研究顯示：RAMP1修飾的MSCs能夠抑制球囊損傷后中膜VSMCs增殖，促進損傷血管快速內(nèi)皮化，減輕損傷血管后炎癥細胞因子的表達，抑制內(nèi)膜增生，從而減輕血管成形術(shù)后的再

4、狹窄，但具體作用環(huán)節(jié)及機制尚不明確。我們推測上述結(jié)果可能與RAMP1抑制VSMCs增殖有關(guān)，而此抑制作用最終可能是RAMP1通過對CGRP的調(diào)控而實現(xiàn)的。為了驗證上述推測，本研究擬通過構(gòu)建高表達RAMP1的VSMCs和沉默RAMP1的VSMCs，觀察RAMP1對VSMCs增殖的影響，并在此基礎(chǔ)之上采用CGRP與RAMP1共干預的方法進一步探討RAMP1對VSMCs的作用機制是否是通過調(diào)節(jié)VSMCs對CGRP的敏感性而實現(xiàn)的，同時測定攜帶

5、CGRP的慢病毒轉(zhuǎn)染MSCs后，MSCs中CGRP的分泌量，之后通過與VSMCs共培養(yǎng)的方法觀察高表達CGRP的MSCs是否能夠穩(wěn)定發(fā)揮CGRP的生物學效應，以期為本課題組下一步利用以CGRP為目的基因修飾的MSCs治療血管成形術(shù)后再狹窄的體內(nèi)研究，提供更為充分的前期實驗準備。
　　 方法：
　　 第一部分
　　 分別構(gòu)建高表達RAMP1慢病毒載體(Lenti-GFP-RAMP1，簡稱RAMP1+/+)、沉默RA

6、MP1慢病毒載體(Lenti-GFP-shRAMP1，簡稱RAMP1-/-)及空病毒載體(Lenti-GFP，簡稱GFP+/+)，分離獲得大鼠胸主動脈VSMCs，細胞培養(yǎng)經(jīng)同步化后，將上述已成功構(gòu)建的慢病毒載體分別轉(zhuǎn)染至VSMCs，實驗分為四組：RAMP1+/+轉(zhuǎn)染VSMCs組(簡稱VSMCsRAMP1+/+組)、RAMP1-/-轉(zhuǎn)染VSMCs組(簡稱VSMCsRAMP1-/-組)、GFP+/+空病毒轉(zhuǎn)染VSMCs組(簡稱VSMCsGF

7、P+/+組)和VSMCs對照組，每組又分為24h、48h、72h和96h共4個亞組。分別應用流式細胞技術(shù)測定慢病毒的轉(zhuǎn)染率；ELISA法測定不同時間點各亞組RAMP1的蛋白分泌量以確定最佳感染時間點；應用RT-PCR和Western blot技術(shù)分別檢測各組VSMCs中RAMP1的基因和蛋白表達水平。此外，在慢病毒轉(zhuǎn)染后6h加入AngⅡ誘導細胞增殖以模擬血管內(nèi)VSMCs增殖模型，應用MTT法、流式細胞技術(shù)和Western blot技術(shù)檢

8、測各亞組細胞的增殖、凋亡、周期變化以及收縮蛋白α-SM-actin(α-Smooth Muscle Antibody，α-SM-actin)、合成型蛋白骨橋蛋白(osteopontin，OPN)的表達變化；細胞劃痕實驗觀察各組VSMCs的遷移能力。
　　 第二部分
　　 CGRP蛋白直接接觸法：為了觀察RAMP1在CGRP抑制VSMCs增殖過程中的作用途徑，以一定濃度的CGRP蛋白干預上述VSMCsRAMP+/+、VSM

9、CsRAMP1-/-及正常VSMCs；實驗分組如下：VSMCs對照組、CGRP+VSMCs組、CGRP+VSMCsRAMP1+/+組、CGRP+VSMCsRAMP1-/-組。分別應用MTT法和流式細胞術(shù)技術(shù)檢測各組VSMCs的增殖、凋亡及周期變化。
　　 細胞共培養(yǎng)法：為了進一步驗證上述實驗結(jié)果，同時觀察高表達CGRP的慢病毒載體轉(zhuǎn)染到MSCs后能否繼續(xù)保持CGRP原有的生物學效應。首先構(gòu)建高表達CGRP的慢病毒載體(Lenti

10、-GFP-CGRP，簡稱CGRP+/+)并轉(zhuǎn)染MSCs，使之成為高表達CGRP的MSCs(MSCsCGRP+/+)。使用ELISA法檢測上述MSCsCGRP+/+上清液中CGRP蛋白分泌量。此后，應用MSCsCGRP+/+分別與上述VSMCsRAMP1+/+、VSMCsRAMP1-/-及正常VSMCs共培養(yǎng)，實驗分組如下：MSCsCGRP+/++VSMCsRAMP1+/+組、MSCsCGRP+/++VSMCsRAMP1-/-組、MSCs

11、CGRP+/++VSMCs組、MSCs+VSMCs組、單純VSMCs作為對照組。分別應用流式細胞術(shù)、Western blot技術(shù)檢測各組VSMCs的凋亡、周期變化以及收縮蛋白α-SM-actin、合成型蛋白OPN的表達變化。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分
　　 慢病毒轉(zhuǎn)染細胞72h后綠色熒光蛋白表達最強。當RAMP1+/+轉(zhuǎn)染VSMCs后，細胞中RAMP1基因水平及蛋白表達均較對照組明顯增高(P<0.05)；而R

12、AMP1-/-轉(zhuǎn)染VSMCs后，細胞中RAMP1基因水平及蛋白表達較對照組明顯減低(P<0.05)。同時，RAMP1+/+的轉(zhuǎn)染能夠抑制AngⅡ誘導的VSMCs增殖，促進細胞早期凋亡，使細胞停留在靜止期相對增多，收縮蛋白α-SM-actin表達增加，細胞遷移率明顯降低，上述現(xiàn)象與對照組比較有顯著差異性(P<0.05)，表明高表達RAMP1明顯抑制VSMCs增殖；相反，沉默RAMP1則能夠促進AngⅡ誘導的VSMCs增殖，使細胞停留在靜止

13、期相對減少，同時合成型蛋白OPN表達增加，細胞遷移率增加，上述結(jié)果與對照組比較有顯著差異性(P<0.05)；而GFP+/+轉(zhuǎn)染組，即空病毒轉(zhuǎn)染對VSMCs的增殖、凋亡和表型的轉(zhuǎn)變均無明顯影響，與對照組比較無顯著差異性(P>0.05)。
　　 第二部分
　　 CGRP蛋白直接接觸法：MTT結(jié)果顯示，與對照組比較CGRP蛋白的干預明顯抑制了VSMCs的增殖(P<0.05)；同時流式細胞技術(shù)檢測結(jié)果也發(fā)現(xiàn)CGRP蛋白干預后的V

14、SMCs早期凋亡增多，停留在靜止期的細胞數(shù)目較對照組明顯增加(P<0.05)；而應用CGRP蛋白干預高表達RAMP1慢病毒載體轉(zhuǎn)染的VSMCs，即VSMCsRAMP+/+時，CGRP的上述抑制作用明顯增強(P<0.05)；相反，當CGRP蛋白干預沉默RAMP1慢病毒載體轉(zhuǎn)染的VSMCs，即VSMCsRAMP1-/-時，CGRP的上述抑制作用明顯減弱(P<0.05)。
　　 細胞共培養(yǎng)法：CGRP+/+轉(zhuǎn)染MSCs后(即MSCsC

15、GRP+/+)，ELISA法檢測結(jié)果顯示其上清液中CGRP蛋白分泌量較對照組顯著增加(P<0.05)；MSCsCGRP+/+分別與高表達和沉默RAMP1的VSMCs共培養(yǎng)后，CGRP所表現(xiàn)出的作用與CGRP蛋白直接接觸法結(jié)果是一致的。同時，Western blot結(jié)果還顯示：MSCsCGRP+/+與VSMCs共培養(yǎng)能夠促使VSMCs中收縮型蛋白α-SM-actin表達增高，合成型OPN表達降低(P<0.05)；當MSCsCGRP+/+與

16、高表達RAMP1的VSMCs共培養(yǎng)時上述表性改變顯著增加(P<0.05)，反之；當MSCsCGRP+/+與沉默RAMP1的VSMCs共培養(yǎng)時則上述表性改變顯著減弱(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 第一部分
　　 高表達RAMP1能明顯抑制AngⅡ誘導的VSMCs增殖，促進細胞早期凋亡，同時影響細胞表型轉(zhuǎn)變。而沉默RAMP1后，上述作用減弱，由此說明RAMP1對VSMCs具有一定的抑制作用。
　　 第

17、二部分
　　 高表達或沉默RAMP1的VSMCs可改變細胞對CGRP的敏感性，即高表達RAMP1可增強CGRP對VSMCs增殖的抑制作用并促進細胞凋亡，同時抑制細胞表型由收縮型向合成型轉(zhuǎn)變；反之，沉默RAMP1則可減弱CGRP對VSMCs的上述作用。此結(jié)果進一步說明RAMP1是CGRP發(fā)揮生物學效應的關(guān)鍵肽；細胞共培養(yǎng)結(jié)果證明了CGRP轉(zhuǎn)染至MSCs后，能夠高分泌CGRP，并可穩(wěn)定發(fā)揮CGRP的生物學效應，由此，上述結(jié)果為CGR