過氧化氫對人肝癌細(xì)胞株hepg2增殖的促進(jìn)作用

1、<p>　　過氧化氫對人肝癌細(xì)胞株HepG2增殖的促進(jìn)作用</p><p>　　作者：李成剛，高志清，劉瑞，梁欣，海春旭 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 過氧化氫 </p><p>　　【Abstract】 AIM: To study the role of low concentration of H2O2 in promoting the pro

2、liferation of HepG2 cells so as to examine the role of NFκB and cell cycle in that process. METHODS: HepG2 cells were stimulated directly by H2O2. HepG2 cells were previously treated by 20 μmol/L PDTC for 2 hours before

3、 they were treated by 50 μmol/L H2O2. HepG2 cells in various phases of cell cycle were treated by 50 μmol/L H2O2. The proliferation of HepG2 cells was detected by MTT assay. RESULTS: H2O2 of 50</p><p>　　【

4、Keywords】 hydrogen peroxide; HepG2 cells line; cell division; cell cycle </p><p>　　【摘要】 目的： 探討低劑量過氧化氫（H2O2）對人肝癌細(xì)胞株HepG2的促增殖作用及該作用與NFκB和細(xì)胞周期的關(guān)系. 方法： 不同劑量H2O2直接作用于培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞；20 μmol/L NFκB抑制劑（PDTC）預(yù)處理細(xì)胞2 h,

5、50 μmol/L的H2O2作用HepG2細(xì)胞；50 μmol/L H2O2分別作用于G1, G2/M, S期細(xì)胞，MTT法測定細(xì)胞增殖活性. 結(jié)果： 50 μmol/L的H2O2具有明顯的促進(jìn)HepG2細(xì)胞生長的作用，此作用可以被PDTC抑制；50 μmol/L的H2O2可以明顯的促進(jìn)G1期HepG2細(xì)胞生長. 結(jié)論： 低劑量H2O2可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞增殖，該過程可能包含依賴NFκB的信號途徑的參與；H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)

6、胞增殖在細(xì)胞周期的不同時相效應(yīng)敏感性不同，主要誘導(dǎo)G1期細(xì)胞增殖. </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 過氧化氫；HepG2細(xì)胞系；細(xì)胞分裂；細(xì)胞周期 </p><p><b>　　0引言 </b></p><p>　　近年來對于活性氧（reactive oxygen species, ROS）、自由基(free radicals, RF)對細(xì)胞

7、增殖作用的研究越來越多. 有研究表明，ROS不僅可以刺激正常細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化，也可以刺激腫瘤細(xì)胞增殖［1-3］，它還可以通過參與信號途徑來促進(jìn)細(xì)胞表達(dá)多種參與生理、病理過程所需要的分子［4］，且這種作用存在時間―效應(yīng)關(guān)系和劑量―效應(yīng)關(guān)系. 但對于外源性H2O2直接作用于腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞增殖與啟動信號途徑和細(xì)胞敏感周期關(guān)系的研究還很少，我們通過H2O2作用于人肝癌細(xì)胞株HepG2，初步探討其促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖與NFκB途徑和細(xì)胞敏感時相的關(guān)

8、系. </p><p><b>　　1材料和方法 </b></p><p><b>　　1.1材料 </b></p><p>　　肝癌細(xì)胞株HepG2由第四軍醫(yī)大學(xué)病理學(xué)教研室惠贈；RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；新生牛血清為鄭州佰安生物公司產(chǎn)品；H2O2為西安試劑廠產(chǎn)品，4℃避光保存；Thiazolyl B

9、lue, Dimethyl Sulfoxide （DMSO）, Pyrrolidine dithiocarbamate （PDTC） 、胸腺嘧啶核苷（TdR）均購自美國Sigma公司；970CRT熒光分光光度計由上海三科儀器有限公司生產(chǎn)，ZS2板式酶標(biāo)儀為北京新風(fēng)機電技術(shù)公司產(chǎn)品. </p><p><b>　　1.2方法 </b></p><p>　　1.2.1細(xì)胞

10、培養(yǎng)HepG2細(xì)胞經(jīng)2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代后，接種于RPMI1640完全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中含100 mL/L新生牛血清、2 g/L NaHCO3、鏈霉素100 mg/L、青霉素10×104 u/L，置37℃，50 mL/L CO2及飽和濕度孵箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀態(tài). </p><p>　　1.2.2MTT比色法檢測細(xì)胞增殖活性取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞2.5 g/L胰蛋白酶消化，用

11、含100 mL/L新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基終止消化，調(diào)整細(xì)胞密度為5×107/L，以每孔200 μL接種于96孔板，培養(yǎng)12 h后加入終濃度分別為0.1, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 1000 μmol/L的H2O2，另外設(shè)陰性對照孔并用單純培養(yǎng)基作空白孔. 細(xì)胞分別于H2O2處理1, 24和48 h后每孔加入5 g/L MTT 20 μL, 37℃孵育4 h后終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液

12、，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min使紫色結(jié)晶物充分溶解，用ZS2板式酶標(biāo)儀，波長為492 nm，檢測各孔吸光度值. </p><p>　　1.2.3PDTC對H2O2促增殖作用的影響細(xì)胞接種方法同前，培養(yǎng)10 h后，每孔加入終濃度為20 μmol/L PDTC 2 h后，以終濃度為50 μmol/L的H2O2分別處理1, 24和48 h, MTT法檢測細(xì)胞增殖狀況，方法同前. </p>

13、<p>　　1.2.4TdR誘導(dǎo)細(xì)胞同步化取處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，用終濃度為2.5 mmol/L的TdR分別同步化得到S, G2/M和G1期HepG2細(xì)胞，具體方法參照文獻(xiàn)［5］. </p><p>　　1.2.5H2O2對同步化細(xì)胞的作用取按上述方法所得S, G2/M和G1期細(xì)胞，用終濃度為50 μmol/L 的H2O2分別作用1, 24, 48 h, MTT法檢測增殖效果，方法同前.

14、</p><p>　　統(tǒng)計學(xué)處理： 實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，采用方差分析比較組間差異，組間差別的多重比較采用Dunnettt檢驗方法. 數(shù)據(jù)處理采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行. </p><p><b>　　2結(jié)果 </b></p><p>　　2.1不同劑量H2O2對HepG2細(xì)胞的作用實驗結(jié)果顯示，50 μmol/L終濃度的H2O

15、2作用細(xì)胞24 h后，吸光度值與對照組相比顯著升高（P&lt;0.01）；1 mmol/L H2O2作用細(xì)胞1 h后，吸光度值與對照組相比明顯降低（P&lt;0.05, Fig 1）. </p><p>　　2.2PDTC對H2O2促增殖作用的抑制作用20 μmol/L PDTC預(yù)處理細(xì)胞2 h后，給予50 μmol/L H2O2作用細(xì)胞，吸光度值與對照組相比無顯著性差異（P&gt;0.0

16、5），而單獨給予50 μmol/L H2O2作用細(xì)胞24 h，吸光度值與對照組相比顯著升高（P&lt;0.01, Fig 2）. </p><p>　　2.3H2O2對同步化HepG2細(xì)胞的作用50 μmol/L H2O2作用G1期細(xì)胞后，與對照組相比，吸光度值顯著升高（P&lt;0.05），而50 μmol/L H2O2作用S, G2/M期細(xì)胞后，光吸收值與對照組相比，無顯著性差異（Tab 1）

17、.表150 μmol/L H2O2對不同時相HepG2細(xì)胞增殖的影響（略） </p><p><b>　　3討論 </b></p><p>　　活性氧、自由基是體內(nèi)一系列重要的生物活性分子，參與多種生理、病理過程［6，7］. 細(xì)胞信號途徑可以被諸如活性氧（ROS）、活性氮（RNS）等間接啟動，或是直接由質(zhì)膜與刺激因素接觸并被上皮細(xì)胞或是間質(zhì)細(xì)胞攝取. 細(xì)胞信號級聯(lián)反應(yīng)

18、可以引起氧化還原敏感轉(zhuǎn)錄因子、NFκB, AP1的活化，這些轉(zhuǎn)錄因子的活化可能與控制細(xì)胞發(fā)生增殖反應(yīng)有關(guān)［8］. 許多研究表明，細(xì)胞增殖是通過包含以ROS作為信號分子在內(nèi)的信號途徑的調(diào)控來實現(xiàn)的［9］，并且一些刺激細(xì)胞在發(fā)生增殖反應(yīng)的過程中，ROS作為信號分子是必需的. 外源性活性氧信號和細(xì)胞內(nèi)源性活性氧信號都參與了促進(jìn)細(xì)胞增殖的過程［10］，而且許多證據(jù)表明氧化信號刺激細(xì)胞增殖部分是通過活化NFκB來實現(xiàn)的［11］. </p&g

19、t;<p>　　NFκB已被證明是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長的一種主要物質(zhì)［12］，一般情況下NFκB與抑制分子IκB結(jié)合以非活化形式存在于細(xì)胞質(zhì)中. 當(dāng)NFκB被H2O2等刺激活化后，IκB發(fā)生磷酸化和泛素化，繼而降解而與NFκB解離，由p50和p65兩個亞基組成的NFκB二聚體從細(xì)胞質(zhì)快速轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中［13］，該過程涉及到參與細(xì)胞增殖、凋亡和遷移有關(guān)基因的表達(dá)，并受到氧化/還原過程的調(diào)控. ROS對NFκB的活化可能是必需的，內(nèi)源

20、性H2O2引起向核內(nèi)轉(zhuǎn)移的p65增多，并伴有NFκBDNA結(jié)合物及反式激活的基因數(shù)量減少，同時氧化應(yīng)激本身也可以促進(jìn)NFκB由胞質(zhì)向核內(nèi)轉(zhuǎn)移. </p><p>　　本實驗利用MTT比色法檢測了H2O2對HepG2細(xì)胞的促增殖作用，結(jié)果顯示50 μmol/L終濃度的H2O2作用HepG2細(xì)胞后，吸光度值與對照組相比顯著升高，提示50 μmol/L終濃度的H2O2促進(jìn)了該腫瘤細(xì)胞發(fā)生增殖反應(yīng)；20 μmol/L P

21、DTC預(yù)處理組細(xì)胞與對照組相比，吸光度值有所升高，但無顯著性差異，提示H2O2的促腫瘤細(xì)胞增殖作用可以被NFκB抑制劑部分抑制，間接說明了H2O2促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的過程中有包括NFκB途徑的參與. 與此同時，1 mmol/L H2O2處理組與對照組相比，1 h后吸光度值已顯著降低，提示高濃度H2O2損傷細(xì)胞時存在瞬時效應(yīng). </p><p>　　以往研究發(fā)現(xiàn)中濃度的H2O2作用可引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，并且這種作用

22、與細(xì)胞敏感時相有關(guān)［5］. 基于這些結(jié)果，我們探討了低劑量H2O2促腫瘤細(xì)胞增殖作用與細(xì)胞周期的關(guān)系. 實驗結(jié)果顯示，用50 μmol/L H2O2作用于同步化G1期細(xì)胞后，與對照組相比，光吸收值顯著升高，提示H2O2對該期細(xì)胞具有促增殖作用，而50 μmol/L H2O2作用于同步化S, G2/M期細(xì)胞后，吸光度值與對照組相比無顯著變化，提示G1期為H2O2發(fā)揮促增殖作用的主要時期. 因此，H2O2促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖可能與細(xì)胞敏感時相有

23、關(guān)，其作用機制有待進(jìn)一步探討. </p><p><b>　　【參考文獻(xiàn)】 </b></p><p>　?。?］ 李蕓，廖鋼陵，鄧建籽，等. 超氧陰離子自由基促肝卵圓細(xì)胞株WBF344增殖、轉(zhuǎn)化作用的研究 </p><p>　?。跩］. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報，2000；22（2）：106-110. </p><p>　　

24、Li Y, Liao GL, Deng JZ, et al. Study on the superoxide anion in promoting proliferation and transformation of rat liver oval cell line WBF344 ［J］. Acta Acad Med Sin, 2000；22（2）：106-110. </p><p>　?。?］ 劉珊林，劉冠

25、中，程建，等. 蛋白激酶對活性氧調(diào)節(jié)7721人肝癌細(xì)胞生長的影響［J］. 生物化學(xué)與生物物理學(xué)報，2002；34 (1)：67-72. </p><p>　　Liu SL, Liu GZ, Cheng J, et al. Influence of PKB on ROS regulation of proliferation in human 7721 hepatoma cells ［J］. Acta Bioch

26、im Biophys Sin, 2002；34 (1)：67-72. </p><p>　?。?］ Dominici S, Visvikis A, Pieri L, et al. Redox modulation of NFkappaB nuclear translocation and DNA binding in metastatic melanoma. The role of endogenous and

27、 gammaglutamyl transferasedependent oxidative stress ［J］. Tumori, 2003;89 (4):426-433. </p><p>　?。?］ 李成剛，海春旭. ROS對樹突細(xì)胞表型和功能成熟作用的研究進(jìn)展［J］. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2004；25（4）：382-384. </p><p>　　Li CG, Hai CX. Th

28、e effects of ROS on phenotype and function maturation of dendritic cells ［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2004；25（4）：382-384. </p><p>　?。?］ 高志清，海春旭，梁欣，等. 過氧化氫誘導(dǎo)同步化HepG2細(xì)胞DNA損傷和凋亡的敏感時相研究［J］. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2004；25（8）：71

29、0-712. </p><p>　　Gao ZQ, Hai CX, Liang X, et al. Effect of hydrogen peroxide on DNA injury and apoptosis in synchronous HepG2 cells treated by thymidine ［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2004；25（8）：710-712. </p

30、><p>　?。?］ Policastro L, Molinari B, Larcher F, et al. Imbalance of antioxidant enzymes in tumor cells and inhibition of proliferation and malignant features by scavenging hydrogen peroxide ［J］. Mol Carcinog,

31、2004；39 (2)：103-113. </p><p>　　［7］ Nagy G, Koncz A, Perl A. T cell activation induced mitochondrial hyperpolarization is mediated by Ca2+ and redoxdependent production of nitric oxide ［J］. J Immunol, 2003；1

32、71(10)：5188-5197. </p><p>　?。?］ RamosNino ME, Haegens A, Shukla A, et al. Role of mitogenactivated protein kinases (MAPK) in cell injury and proliferation by environmental particulates ［J］. Mol Cell Bioche

33、m, 2002；234-235：111-118. </p><p>　　［9］ Sauer H, Neukirchen W, Rahimi G, et al. Involvement of reactive oxygen species in cardiotrophin1induced proliferation of cardiomyocytes differentiated from murine embr

34、yonic stem cells ［J］. Exp Cell Res, 2004；294 (2)：313-324. </p><p>　　［10］ Zhang Q, Zeng X, Guo J, et al. Effects of homocysteine on murine splenic B lymphocyte proliferation and its signal transduction mechan

35、ism ［J］. Cardiovasc Res, 2001；52 (2)：328-336. </p><p>　?。?1］ Brar SS, Kennedy TP, Sturrock AB, et al. NADPH oxidase promotes NFkappaB activation and proliferation in human airway smooth muscle ［J］. Am J Phys

36、iol Lung Cell Mol Physiol, 2002；282 (4)：782-795. </p><p>　?。?2］ Yao P, Zhan Y, Xu W, et al. Hepatocyte growth factorinduced proliferation of hepatic stemlike cells depends on activation of NFkappaB ［J］. J H