TRAIL活性片段的基因合成、原核表達(dá)及對肝癌細(xì)胞HepG-2的影響.pdf

1、根據(jù)GenBank中人TRAIL基因編碼的氨基酸序列(編碼第111-281位氨基酸),按照大腸桿菌密碼子偏好性原則,設(shè)計(jì)24條用于基因拼接的正反鏈DNA引物,在首尾引物的5’端和3’端分別帶有便于與載體連接的EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn)。以引物自身為模板,進(jìn)行四輪PCR擴(kuò)增,得到的513bp的目的基因的DNA片段,將得到的目的DNA片段插入到表達(dá)載體PET23a上,將篩選獲得的重組載體送去上海英駿公司測序,將序列完全正確的重組載體DNA

2、轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)?？寺〉腡RAIL基因成功地在大腸桿菌中表達(dá)。實(shí)驗(yàn)顯示:在17℃條件下,使用0.5MmIPTG誘導(dǎo)10小時(shí),TRAIL蛋白表達(dá)量達(dá)到最大。為了分離純化TRAIL蛋白,首先利用40％-60％硫酸銨進(jìn)行分級分離。然后利用CM Sepharose陽離子交換柱進(jìn)行離子交換層析,再利用Butyl-Sepharose4B進(jìn)行疏水層析。經(jīng)過三種不同方法的分離與純化,目的蛋白在13％的SDS-PAGE上只顯示一條帶,即

3、達(dá)到電泳純。從1L菌液純化得到6.2mg純凈的TRAIL蛋白。
　　 純化后的TRAIL蛋白以肝癌細(xì)胞株HepG-2為作用對象,通過觀察細(xì)胞形態(tài),MTT法和DNA凝膠電泳法鑒定了TRAIL蛋白的活性。MTT結(jié)果顯示,TRAIL可明顯抑制HepG-2細(xì)胞增殖,并具有顯著的量效關(guān)系,即抑制率隨著劑量的增加而增大。當(dāng)TRAIL濃度為1000ng/ml時(shí),抑制率達(dá)到最大為80％。細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果顯示,1000ng/ml的TRAIL處理2

4、4h時(shí),細(xì)胞質(zhì)濃縮,大量細(xì)胞脫落并懸浮于培養(yǎng)液中。誘導(dǎo)過程中細(xì)胞總DNA檢測結(jié)果顯示,細(xì)胞經(jīng)過TRAIL蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生了典型的DNA梯形條帶,證實(shí)細(xì)胞的確產(chǎn)生凋亡。
　　 本實(shí)驗(yàn)采用了TRAIL分別與三種天然藥物聯(lián)合作用于HepG-2的方法來判斷兩者之間是否存在著協(xié)同作用。MTT結(jié)果顯示,當(dāng)TRAIL與白藜蘆醇聯(lián)合作用時(shí),對HepG-2的抑制效應(yīng)只是兩者單獨(dú)作用時(shí)的疊加值;當(dāng)TRAIL與姜黃素共同作用時(shí),對HepG-2的抑制率比疊