現(xiàn)代聯(lián)用分析技術(shù)在中藥藥效成分辨識(shí)中的應(yīng)用研究.pdf

1、中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究不僅要求對其中指標(biāo)性成分進(jìn)行精確的含量測定,還需對其中所含各類化學(xué)成分進(jìn)行鑒別,從而達(dá)到整體全面地控制與評價(jià)中藥質(zhì)量。中藥藥效成分的研究不僅要求對其本身所含化學(xué)成分進(jìn)行區(qū)分鑒別,還需對其入血成分進(jìn)行分析測定,確定可能的藥效成分,同時(shí)進(jìn)一步對其體內(nèi)代謝過程和作用機(jī)理進(jìn)行研究,結(jié)合中藥方證模型和藥理指標(biāo)來評價(jià)藥效,最終確定中藥方證相關(guān)的有效成分。 中藥成分分析研究的復(fù)雜性與整體性,決定了單靠一種類型的分析技術(shù)并

2、不能滿足中藥分析的要求,所以必須考慮采用多種聯(lián)用分析技術(shù)進(jìn)行綜合分析,發(fā)揮各種聯(lián)用技術(shù)的優(yōu)勢。本論文基于現(xiàn)代聯(lián)用分析技術(shù),以五味子和白芷兩味中藥為研究對象,從體內(nèi)外成分分析入手,建立了一套用于中藥體內(nèi)外成分鑒別與藥效成分初步篩選的方法與模式,并將這些方法及相關(guān)技術(shù)應(yīng)用于中藥全面質(zhì)量控制與體內(nèi)多成分藥代動(dòng)力學(xué)研究中。在此基礎(chǔ)上,根據(jù)目的不同分別比較了各聯(lián)用分析技術(shù)在體內(nèi)外成分分析中的優(yōu)缺點(diǎn)。針對中藥成分分析的要求,發(fā)展建立了綜合HPLC-

3、DAD,HPLC-MS,HPLC-TOF/MS,HPLC-QIT/MS,GC-MS共同用于中藥復(fù)雜成分快速分析鑒別的方法與研究模式。以五味子中木脂素類成分和白芷中香豆素類成分為分析對象,綜合HPLC-DAD,HPLC-TOF/MS,HPLC-QIT/MS三種聯(lián)用分析技術(shù)對中藥體內(nèi)外所含主要化學(xué)成分進(jìn)行了分析鑒別,對主要化學(xué)成分的質(zhì)譜碎裂規(guī)律進(jìn)行了初步解析。 實(shí)驗(yàn)中分別對五味子藥材的提取條件進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化,以五味子藥材中已有的六個(gè)

4、對照品為指標(biāo),系統(tǒng)考察了影響五味子藥材提取效率的各個(gè)因素,包括提取時(shí)間,提取溶劑,提取次數(shù)等,最終確定采用甲醇超聲提取30min作為提取條件。HPLC-DAD色譜圖顯示各色譜峰均實(shí)現(xiàn)良好分離；借助HPLC-TOF/MS對五味子中21個(gè)化學(xué)成分進(jìn)行了初步定性。然后利用離子阱技術(shù)對六個(gè)木脂素類成分對照品進(jìn)行了多級裂解分析,各木脂素類成分的多級裂解具有共同的規(guī)律可循：木脂素類成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)具有共同的結(jié)構(gòu)母核,區(qū)別僅在于連接在其結(jié)構(gòu)母核上的基團(tuán)

5、不同,從木脂素類成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)上看,大多數(shù)木脂素類成分其結(jié)構(gòu)母核上的連接基團(tuán)為-CH3,-OH,-OCH3等,這使得木脂素類成分在進(jìn)行碎片裂解時(shí),容易形成[M+H-15]+,[M+H-18]+,[M+H-31]+的碎片離子。如果在木脂素類成分結(jié)構(gòu)母核的C-7位上連接有-OH基團(tuán),由于連接-OH的相鄰C均為飽和烴形式,因此其很容易失去一分子水形成雙鍵。脫水后在C-7和C-8形成雙鍵。在系統(tǒng)總結(jié)五味子中木脂素類成分裂解規(guī)律的基礎(chǔ)上,對五味子

6、中三組同分異構(gòu)體化合物通過多級碎片裂解分析進(jìn)行了區(qū)分鑒別。 香豆素與木脂素類成分同屬于苯丙素類成分。同樣,綜合三種技術(shù)共同應(yīng)用于中藥白芷中香豆素類成分的鑒別與結(jié)構(gòu)解析。采用HPLC-TOF/MS對白芷中15個(gè)主要香豆素類成分進(jìn)行了初步鑒別,然后利用離子阱技術(shù)對兩個(gè)香豆素類成分對照品進(jìn)行了多級裂解分析,香豆素類成分的多級裂解具有共同的規(guī)律可循：香豆素類成分的呋喃香豆素結(jié)構(gòu)母核相對穩(wěn)定,所以在對其進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)裂解時(shí),首先脫去連接在呋

7、喃香豆素結(jié)構(gòu)母核上的單氧取代結(jié)構(gòu)基團(tuán),使結(jié)構(gòu)母核上的氧轉(zhuǎn)生成羰基,進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)裂解時(shí),根據(jù)其連接基團(tuán)不同,所形成的碎片離子也各不相同。如果在呋喃香豆素結(jié)構(gòu)母核的C-5位連接基團(tuán),則容易形成[M+H-R-44]+的碎片離子,[M+H-R-44]+的碎片離子的信號(hào)強(qiáng)度要高于[M+H-R-28]-;如果在C-8位連接基團(tuán),則容易形成[M+H-28]-的碎片離子,[M+H-R-28]+的碎片離子要比[M+H-R-44]-的信號(hào)強(qiáng)。如果烷氧取代基

8、在C-5和C-8同時(shí)存在,它的碎片峰則只有脫去CO的而沒有脫去CO2的。在此基礎(chǔ)上,采用HPLC-QIT/MS對白芷中三組同分異構(gòu)體,通過多級碎片裂解分析進(jìn)行了區(qū)分鑒別。采用GC-MS分析技術(shù),對五味子中揮發(fā)油成分進(jìn)行了分析鑒別與定性研究,由于GC-MS聯(lián)用儀配有EI離子源,EI離子源所得質(zhì)譜圖具有重現(xiàn)性高,有相應(yīng)的化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫等特點(diǎn),可借助計(jì)算機(jī)檢索與質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫自動(dòng)匹配進(jìn)行鑒別分析,實(shí)驗(yàn)中共成功鑒別出五味子中47個(gè)揮發(fā)油成分。

9、 在對中藥材化學(xué)成分分析鑒別的基礎(chǔ)上,通過給SD大鼠灌胃給藥五味子提取物,綜合三種聯(lián)用技術(shù),對比體外五味子藥材化學(xué)成分峰,對大鼠血漿中成分進(jìn)行分析鑒別,共成功鑒別出大鼠血漿中11個(gè)木脂素類原型成分,并建立了中藥體內(nèi)吸收成分指紋圖譜。 在系統(tǒng)考察了色譜條件和樣品前處理方法的基礎(chǔ)上,建立了采用HPLC法同時(shí)測定五味子中六個(gè)木脂素類成分的含量測定方法；并對該方法進(jìn)行了系統(tǒng)的方法學(xué)驗(yàn)證,方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明該含量測定方法可用于五味子中六

10、個(gè)木脂素類成分的含量測定。將該方法應(yīng)用于33個(gè)不同產(chǎn)地和批次的五味子藥材和5個(gè)含有五味子藥材的中藥復(fù)方制劑中六個(gè)木脂素類成分的含量測定。結(jié)果表明,不同產(chǎn)地的五味子藥材中六個(gè)木脂素類成分的含量差別很大,以六個(gè)木脂素類成分的總含量計(jì),東北三省的總木脂素類成分的含量較高,其中吉林五味子中總木脂素類成分的含量最高。 采用HPLC-MS方法測定五味子中六個(gè)木脂素類成分的含量,所建立含量測定方法簡便可靠,血漿中內(nèi)源性物質(zhì)均不干擾樣品峰,方法

11、學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明該含量測定方法適合于生物樣品中六個(gè)木脂素類成分的含量測定。該方法成功應(yīng)用于SD大鼠單劑量口服給藥五味子提取物和混懸液和五味子甲素混懸液后的藥代動(dòng)力學(xué)研究。單劑量口服給藥五味子提取物混懸液和五味子甲素混懸液后,大鼠體內(nèi)六個(gè)木脂素類成分的血藥濃度個(gè)體差異較大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明五味子提取物中五味子甲素、對照品甲素二者藥-時(shí)曲線圖,除提取物有一個(gè)二次吸收峰外,其余部分大致相近,但藥動(dòng)學(xué)參數(shù)并不一致,五味子甲素單體從吸收到消除歷程較提取

12、物中甲素快,單體甲素歷時(shí)24h,提取物中甲素歷時(shí)48h。單體甲素的T1/2、Cmax、AUC、MRT、Vss等參數(shù)均小于提取物中甲素,但C1/F值大于后者。這表明五味子甲素單體快于五味子提取中甲素的吸收和代謝速度。灌胃給藥五味子提取物后,五味子中其它木脂素類成分的藥-時(shí)曲線成雙峰,這可能與腸肝循環(huán)有關(guān),醇甲、酯甲、乙素的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)中Tmax明顯大于其它木脂素類成分,顯示吸收和代謝慢于其它三個(gè)成分。五味子提取物灌胃給藥后藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果提示

13、,中藥提取物混合給藥的藥效作用增強(qiáng),顯示中藥中化學(xué)成分協(xié)同配伍作用的內(nèi)涵。采用現(xiàn)代聯(lián)用分析技術(shù)對中藥體內(nèi)外化學(xué)成分進(jìn)行指標(biāo)性化學(xué)成分含量測定與主要化學(xué)成分快速鑒別的結(jié)果表明：含量測定方面,各種現(xiàn)代聯(lián)用分析技術(shù)在檢測靈敏度方面:HPLC-MS>HPLC-TOF/MS>HPL-DAD。在化學(xué)成分快速鑒別方面,分別比較HPLC-DAD、HPLC-TOF/MS、HPLC-QIT-MS三種聯(lián)用分析技術(shù),HPLC-DAD可根據(jù)化合物特征性紫外吸收和