“香胃聯(lián)合方組”防治肝硬化腸源性內(nèi)毒素血癥的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　本課題從濕濁角度分析肝硬化腸源性內(nèi)毒素血癥病機(jī)，探討香胃聯(lián)合方組對(duì)復(fù)合因素誘導(dǎo)肝硬化大鼠血漿內(nèi)毒素水平的影響，明確香胃聯(lián)合方組對(duì)內(nèi)毒素導(dǎo)致肝硬化大鼠肝臟保護(hù)作用，揭示香胃聯(lián)合方組防治肝硬化腸源性內(nèi)毒素血癥作用機(jī)理，為肝硬化腸源性內(nèi)毒素血癥的防治提供新的思路和方法。
　　方法：
　　將85只Wistar大鼠隨機(jī)分成正常組10只，香胃聯(lián)合預(yù)防組（簡(jiǎn)稱預(yù)防組）10只，乳果糖預(yù)防組（簡(jiǎn)稱預(yù)對(duì)組）10只及純?cè)炷＝M55

2、只。除正常組外，其余均使用四氯化碳復(fù)合因素制造肝硬化模型。按首次0.5ml/l00g、之后0.3ml/l00g劑量皮下注射40％四氯化碳橄欖油溶液，一周二次，同時(shí)輔以89.5%玉米面、10%豬油和0.5%膽固醇混和飼料喂養(yǎng)，以10%酒精為唯一飲料。造模期間，預(yù)防組給予香砂六君子湯6.875g·kg-1d-1、胃苓湯7.188 g·kg-1d-1隔日交替灌胃；預(yù)對(duì)組給予乳果糖口服溶液2.083g·kg-1d-1灌胃，日一次；正常組和純?cè)炷?/p>

3、組每日一次給予等量生理鹽水1ml/100g灌胃。造模持續(xù)8周。造模過(guò)程中，大鼠死亡19只，其中預(yù)防組死亡1只，預(yù)對(duì)組死亡2只，純?cè)炷＝M死亡12只，用于判定造模情況處死4只，其中正常組處死2只，純?cè)炷＝M處死2只。造模成功后，將純?cè)炷＝M再隨機(jī)分為5組：模型組9只，香胃聯(lián)合方組（簡(jiǎn)稱香胃組）8只，香砂六君子湯組（簡(jiǎn)稱香砂組）8只，胃苓湯組（簡(jiǎn)稱胃苓組）8只，乳果糖對(duì)照組（簡(jiǎn)稱治對(duì)組）8只。預(yù)防組、預(yù)對(duì)組繼續(xù)給予相應(yīng)的藥灌胃；正常組和模型組繼續(xù)

4、給予等量生理鹽水灌胃；香胃組給予香砂六君子湯6.875g·kg-1d-1、胃苓湯7.188 g·kg-1d-1隔日交替灌胃；香砂組給予香砂六君子湯6.875g·kg-1d-1灌胃，日一次；胃苓組給予胃苓湯7.188 g· kg-1d-1灌胃，日一次；治對(duì)組給予乳果糖口服溶液2.083g·kg-1d-1灌胃，日一次；用藥共持續(xù)4周。
　　實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察大鼠的一般狀況及體重變化情況，用藥治療結(jié)束后處死取材。肉眼觀察大鼠新鮮肝臟；計(jì)算大

5、鼠肝重指數(shù)和脾重指數(shù)；全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠血清肝功AST（天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶）、ALT（丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶）、ALB（白蛋白）、GLB（球蛋白）、A/G（白蛋白/球蛋白）指標(biāo)；鱟試劑顯色基質(zhì)法檢測(cè)大鼠血漿內(nèi)毒素水平； ELISA法檢測(cè)大鼠血清 NO(一氧化氮)、HA（透明質(zhì)酸）、LN（層粘連蛋白）、PCⅢ（Ⅲ型前膠原）、Ⅳ-C（Ⅳ型膠原）、TNF-α（腫瘤壞死因子-a）、IL-6（白細(xì)胞介素-6）、IFABP（腸脂肪酸結(jié)合蛋白）、D

6、-乳酸水平；ELISA法檢測(cè)大鼠肝組織Hyp（羥脯氨酸）及小腸組織S-IgA含量；取大鼠肝臟組織作病理切片，進(jìn)行HE染色和Masson染色評(píng)定肝硬化損傷程度；取回腸組織作病理切片，進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠腸黏膜損傷情況；免疫組化法測(cè)大鼠肝組織α-SMA（α-平滑肌肌動(dòng)蛋白）、TLR4（Toll樣受體4）、NF-κB（核轉(zhuǎn)錄因子-κB）表達(dá)；Real-time PCR法檢測(cè)大鼠肝臟組織TLR4mRNA、MyD88mRNA、N

7、F-κB mRNA表達(dá)；Real-time PCR法檢測(cè)大鼠小腸組織Occludin mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1香胃聯(lián)合方組、香砂六君子湯、胃苓湯和乳果糖均能改善大鼠的一般狀況，增加體重，其中香胃組、香砂組、胃苓組之間在體重增加方面無(wú)明顯差異，而與治對(duì)組比較有明顯差異（P＜0.05）；預(yù)防組與香胃組比較有顯著差異（P＜0.01）。
　　2肝重指數(shù)和脾重指數(shù)：與模型組相比，正常組、預(yù)防組、預(yù)對(duì)組、香胃組、胃苓組、

8、香砂組及治對(duì)組差異顯著（P＜0.01）；預(yù)防組與預(yù)對(duì)組之間有明顯差異（P＜0.05）；與預(yù)防組相比，香胃組、胃苓組、香砂組及治對(duì)組有顯著性差異（P＜0.01）；香胃組、胃苓組和香砂組之間無(wú)明顯差異（P＞0.05）；香胃組與預(yù)對(duì)組之間有顯著性差異（P＜0.01）；與治對(duì)組相比，香胃組、胃苓組和香砂組差異明顯（P＜0.05）；與正常組相比，預(yù)防組、預(yù)對(duì)組、香胃組、胃苓組、香砂組及治對(duì)組有顯著性差異（P＜0.01）。
　　3肝功、HA、

9、LN、PCⅢ、Ⅳ-C、NO、TNF-α、IL-6水平及肝組織Hyp 含量：與模型組相比，正常組、預(yù)防組、預(yù)對(duì)組、香胃組、胃苓組、香砂組和治對(duì)組差異顯著（P＜0.01）；預(yù)防組與預(yù)對(duì)組之間有明顯差異（P＜0.05）；與預(yù)防組相比，香胃組、胃苓組、香砂組及治對(duì)組有顯著性差異（P＜0.01）；香胃組、胃苓組和香砂組之間無(wú)明顯差異（P＞0.05）；香胃組與預(yù)對(duì)組之間有明顯差異（P＜0.05或P＜0.01）；與治對(duì)組相比，香胃組、胃苓組

10、和香砂組差異明顯（P＜0.05）；與正常組相比，預(yù)防組、預(yù)對(duì)組、香胃組、胃苓組、香砂組及治對(duì)組有顯著性差異（P＜0.01）；
　　4內(nèi)毒素、IFABP及D-乳酸水平：與模型組相比，正常組、預(yù)防組、預(yù)對(duì)組、香胃組、胃苓組、香砂組及治對(duì)組差異性明顯（P＜0.01）；預(yù)防組與預(yù)對(duì)組之間有明顯差異（P＜0.05）；與預(yù)防組相比，香胃組、胃苓組、香砂組及治對(duì)組有顯著性差異（P＜0.01）；與香胃組相比，胃苓組和香砂組差異明顯（P＜0.05）

11、；與香胃組相比，預(yù)對(duì)組和治對(duì)組有顯著性差異（P＜0.01）；與治對(duì)組相比，胃苓組和香砂組差異明顯（P＜0.05）；胃苓組和香砂組之間無(wú)明顯差異（P＞0.05）；與正常組相比，預(yù)防組、預(yù)對(duì)組、香胃組、胃苓組、香砂組及治對(duì)組有顯著性差異（P＜0.01）。
　　5肝組織病理：各組大鼠肝組織膠原纖維面積百分比結(jié)果顯示：與模型組相比，正常組、預(yù)防組、預(yù)對(duì)組、香胃組、胃苓組、香砂組及治對(duì)組差異顯著（P＜0.01）；預(yù)防組與預(yù)對(duì)組之間有明顯差異

12、（P＜0.05）；與預(yù)防組相比，香胃組、胃苓組、香砂組及治對(duì)組有顯著性差異（P＜0.01）；香胃組、胃苓組和香砂組之間無(wú)明顯差異（P＞0.05）；香胃組與預(yù)對(duì)組之間有顯著性差異（P＜0.01）；與治對(duì)組相比，香胃組、胃苓組和香砂組差異明顯（P＜0.05）；與正常組相比，預(yù)防組、預(yù)對(duì)組、香胃組、胃苓組、香砂組及治對(duì)組有顯著性差異（P＜0.01）。
　　6小腸組織病理：模型組大鼠小腸黏膜上皮細(xì)胞變性、壞死，大量絨毛脫落，固有層裸露，腸

13、黏膜損傷程度重；預(yù)防組與預(yù)對(duì)組大鼠小腸黏膜絨毛頂端上皮下可見囊狀間隙，腸黏膜損傷程度輕，兩組比較，預(yù)防組更輕；香胃組、香砂組與胃苓組大鼠小腸黏膜上皮少數(shù)絨毛頂端脫落，固有層明顯水腫。香胃組與香砂組、胃苓組比較，腸黏膜損傷程度輕，與預(yù)對(duì)組比較腸黏膜損傷程度重；治對(duì)組小腸黏膜損傷程度介于模型組與治療組之間。
　　7肝組織α-SMA、TLR4、NF-κB免疫組化半定量及 TLR4mRNA、MyD88mRNA和NF-κB mRNA表達(dá)結(jié)果

14、：與模型組相比，正常組、預(yù)防組、預(yù)對(duì)組、香胃組、胃苓組、香砂組及治對(duì)組差異性顯著（P＜0.01）。預(yù)防組與預(yù)對(duì)組之間有明顯差異（P＜0.05）；與預(yù)防組相比，香胃組、胃苓組、香砂組及治對(duì)組有顯著性差異（P＜0.01）；香胃組、胃苓組和香砂組之間無(wú)明顯差異（P＞0.05）；香胃組與預(yù)對(duì)組之間有顯著性差異（P＜0.01）；與治對(duì)組相比，香胃組、胃苓組和香砂組差異明顯（P＜0.05或P＜0.01）；與正常組相比，預(yù)防組、預(yù)對(duì)組、香胃組、胃苓組

15、、香砂組及治對(duì)組有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01）。
　　8小腸組織S-IgA含量及Occludin mRNA表達(dá)結(jié)果：與模型組相比，正常組、預(yù)防組、預(yù)對(duì)組、香胃組、胃苓組、香砂組及治對(duì)組差異明顯（P＜0.01）；預(yù)防組與預(yù)對(duì)組之間有明顯差異（P＜0.05）；與預(yù)防組相比，香胃組、胃苓組、香砂組及治對(duì)組有顯著性差異（P＜0.01）；與香胃組相比，胃苓組和香砂組差異明顯（P＜0.05）；與香胃組相比，預(yù)對(duì)組和治對(duì)組有顯著性差

16、異（P＜0.05或P＜0.01）；與治對(duì)組相比，胃苓組和香砂組差異明顯（P＜0.05）；胃苓組和香砂組之間無(wú)明顯差異（P＞0.05）；與正常組相比，預(yù)防組、預(yù)對(duì)組、香胃組、胃苓組、香砂組及治對(duì)組有顯著性差異（P＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　香胃聯(lián)合方組可以有效清除腸道內(nèi)毒素，改善腸黏膜通透性，明顯降低血漿內(nèi)毒素水平，減輕肝臟損傷，延緩大鼠肝硬化的進(jìn)展，早期預(yù)防用藥效果更好。其作用機(jī)理可能為：
　　1香胃聯(lián)合方組通過(guò)減

17、少肝硬化大鼠血清D-乳酸、小腸脂肪酸結(jié)合蛋白水平，降低腸黏膜通透性，增加緊密連接Occludin蛋白表達(dá)，提高S-IgA的分泌水平，從而降低肝硬化大鼠血漿內(nèi)毒素水平。
　　2香胃聯(lián)合方組通過(guò)抑制血漿內(nèi)毒素引起的 TLR4-MyD88-NF-κB信號(hào)通路，下調(diào)TLR4蛋白、MyD88蛋白及NF-κB蛋白表達(dá)，減少血中TNF-α、Il-6和NO水平，從而減輕內(nèi)毒素對(duì)肝硬化大鼠肝臟的損害。
　　3香胃聯(lián)合方組通過(guò)改善肝功，減少血漿