ATM-Nf-kappaB通路在促炎因子TNf-alpha、Il-6促肺癌細胞遷移中的作用研究.pdf

1、[背景和目的]免疫微環(huán)境在肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用，TNF-α和IL-6作為兩種重要的促炎因子，參與了免疫、炎癥反應(yīng)及腫瘤發(fā)生發(fā)展的全過程，為腫瘤相關(guān)炎癥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子且可通過上調(diào)p38、ERK、NF-κB通路誘導(dǎo)MMPs的表達最終促進腫瘤細胞的侵襲和遷移，但這一機制在肺癌中尚不明確。ATM作為DNA損傷信號傳導(dǎo)通路中最早的傳感和中樞調(diào)控基因，可以多種途徑激活NF-κB，從而調(diào)控下游靶基因的表達。此外，最近研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1可

2、激活A(yù)TM調(diào)控乳腺癌細胞的遷移。這些研究表明，ATM除參與DNA損傷修復(fù)外，還與腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移相關(guān)。因此，炎癥因子TNF-α、IL-6對肺癌細胞遷移能力的影響及ATM是否參與其中則為本文研究的重點。
　　[方法]首先以Real-time PCR、ELISA技術(shù)和Transwell細胞遷移實驗檢測肺癌細胞系NCI-H446、A549在TNF-α、IL-6表達及細胞遷移能力上的差異;其次以MMPs抑制劑、siRNA基因沉默技術(shù)抑制/沉

3、默相應(yīng)MMPs表達，Transwell細胞遷移實驗篩選影響肺癌細胞系NCI-H446、A549遷移能力的關(guān)鍵MMPs，并以Western blot、RT-PCR、Real-time PCR驗證TNF-α、IL-6所增強的細胞遷移能力之關(guān)鍵MMPs;再以Western blot、激光共聚焦顯微鏡觀察TNF-α、IL-6致ATM、MAPK、NF-κB通路激活的基礎(chǔ)上，以相關(guān)激酶抑制劑或siRNA阻遏或沉默相關(guān)激酶活性，以Real-time

4、PCR研究相關(guān)激酶在TNF-α、IL-6上調(diào)介導(dǎo)肺癌轉(zhuǎn)移關(guān)鍵MMPs表達中的作用及以Transwell細胞遷移實驗探究上述激酶在TNF-α、IL-6促肺癌轉(zhuǎn)移中的作用;最后對肺癌微環(huán)境各組分給予LPS或化療藥處理，以Real-time PCR、ELISA、流式細胞術(shù)分別探究促炎因子TNF-α、IL-6的來源及表達機制。
　　[結(jié)果](1)與高表達TNF-α、IL-6相一致，肺癌細胞A549相較于NCI-H446細胞具有較高的細胞遷

5、移能力，面對低表達促炎因子TNF-α、IL-6的NCI-H446細胞補充相應(yīng)促炎因子則顯著提高其遷移能力，提示促炎因子TNF-α、IL-6與肺癌細胞的遷移能力直接相關(guān);(2)促炎因子TNF-α、IL-6不僅時間依賴性地上調(diào)MMP-3、MMP-13的表達，而且也顯著增強MMP-3、MMP-13的活性;MMPs廣譜和窄譜抑制劑和MMP-3、MMP-13 siRNA基因沉默不僅抑制A549細胞的遷移能力，而且對促炎因子TNF-α、IL-6所增

6、強的肺癌NCI-H446細胞遷移能力也有明顯的逆轉(zhuǎn)作用;(3) TNF-α、IL-6不僅顯著激活ERK、p38激酶磷酸化，而且ATM和p65的磷酸化水平也因TNF-α、IL-6的作用而顯著上調(diào);(4)阻遏ATM活性可使TNF-α所上調(diào)的ERK、p38、p65磷酸化水平明顯得到抑制，提示ATM是TNF-α激活ERK、p38和NF-κB通路的上游分子;(5)促炎因子TNF-α、IL-6通過激活A(yù)TM-ERK/p38-NF-κB通路促進肺癌細

7、胞遷移;(6) TNF-α、IL-6通過激活A(yù)TM-ERK/p38-NF-κB通路上調(diào)MMP-3、MMP-13表達;(7) LPS及化療藥順鉑、喜樹堿均可明顯促進肺癌NCI-H446細胞、外周血淋巴細胞、成纖維細胞上調(diào)表達促炎因子TNF-α、IL-6;(8)順鉑、喜樹堿通過激活ERK/p38-NF-κB通路促進IL-6分泌。
　　[結(jié)論]本課題以siRNA干擾或激酶抑制劑的使用研究ATM-ERK/p38-NF-κB通路在促炎因子T