IL-6誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞產(chǎn)生化療耐藥的作用及作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：卵巢癌發(fā)病隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)已屬晚期，其治療方法主要是徹底的細(xì)胞減滅術(shù)和以順鉑和紫杉醇為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療，但遠(yuǎn)期療效并不甚理想，耐藥的發(fā)生是制約臨床治療的主要因素。近年來(lái)研究表明，白細(xì)胞介素6(Interleukin6，IL-6)在卵巢癌細(xì)胞中高表達(dá)，IL-6不僅在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，而且還影響卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。目前關(guān)于IL-6在卵巢癌化療耐藥中的作用及作用機(jī)制尚不十分明確，本課題首先觀察了IL-6的表達(dá)對(duì)

2、卵巢癌細(xì)胞化療耐藥的影響，在此基礎(chǔ)上對(duì)其作用機(jī)制及相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行了初步探討。
　　 方法：應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、免疫印跡(Western Blot)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)和MTT法，對(duì)四種國(guó)際公認(rèn)的人上皮性卵巢癌細(xì)胞系的IL-6及其受體

3、(IL-6Rα、gp130)表達(dá)水平與其化療敏感性及耐藥相關(guān)基因和凋亡抑制基因表達(dá)水平進(jìn)行分析。
　　 在此基礎(chǔ)上，選擇不分泌IL-6但表達(dá)其受體，對(duì)順鉑和紫杉醇敏感的A2780細(xì)胞和高表達(dá)IL-6及其受體，對(duì)順鉑和紫杉醇耐藥的SKOV3細(xì)胞為研究模型：(1)分別應(yīng)用MTT法和RT-PCR技術(shù)觀察外源性IL-6是否影響A2780細(xì)胞對(duì)順鉑和紫杉醇的敏感性及對(duì)耐藥相關(guān)基因和凋亡抑制基因表達(dá)的作用；(2)采用脂質(zhì)體法將含正義(sen

4、se，ss)或反義(antisense，as)IL-6 cDNA的表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染至A2780和SKOV3細(xì)胞，應(yīng)用G418篩選出陽(yáng)性克隆，并通過(guò)ELISA法進(jìn)行鑒定。采用上述同樣方法對(duì)穩(wěn)定表達(dá)ss/asIL-6的細(xì)胞克隆進(jìn)行順鉑和紫杉醇敏感性及耐藥相關(guān)基因和凋亡抑制基因表達(dá)的檢測(cè)；(3)應(yīng)用特異性信號(hào)阻斷劑PD98059(MEK1/2抑制劑)和Wortmannin(PI3K抑制劑)，分別觀察其對(duì)外源性IL-6或內(nèi)源性過(guò)表達(dá)IL-6誘導(dǎo)

5、卵巢癌細(xì)胞化療耐藥的阻斷作用。
　　 結(jié)果：(1)四種卵巢癌細(xì)胞除A2780細(xì)胞外均組成性分泌IL-6，其轉(zhuǎn)錄水平與蛋白水平基本一致，且都表達(dá)IL-6受體(IL-6Rα、gp130)；(2)四種卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑和紫杉醇的敏感性不同，其中A2780細(xì)胞最敏感，ES-2細(xì)胞次之，CAOV-3和SKOV-3細(xì)胞則有不同程度的耐藥；(3)部分耐藥相關(guān)基因和凋亡抑制基因在A2780和ES-2細(xì)胞中的表達(dá)水平均較低，而在CAOV-3和SKO

6、V-3細(xì)胞中的表達(dá)水平均較高。(4)外源性IL-6可顯著降低A2780細(xì)胞對(duì)順鉑和紫杉醇的敏感性，并能以劑量依賴的方式上調(diào)耐藥基因MDR1、GST-π和凋亡抑制基因Bcl-2、Bcl-xL、XIAP的表達(dá)；(5)篩選出IL-6低、中、高表達(dá)的A2780克隆，分別命名為A2780/ssIL-6L、A2780/ssIL-6M、A2780/ssIL-6H，和IL-6中、高抑制表達(dá)的SKOV3克隆，分別命名為SKOV3/asIL-6MI、SKO

7、V3/asIL-6HI，及相應(yīng)的空載體pcDNA3.1(+)/A2780和pcDNA3.1(+)/SKOV3克?。?6)與空載體pcDNA3.1(+)/A2780和未轉(zhuǎn)染的A2780細(xì)胞相比，ssIL-6基因轉(zhuǎn)染組細(xì)胞對(duì)順鉑和紫杉醇的敏感性明顯降低，上述耐藥相關(guān)基因和凋亡抑制基因的表達(dá)水平則明顯升高；(7)與空載體pcDNA3.1(+)/SKOV3和未轉(zhuǎn)染的SKOV3細(xì)胞相比，asIL-6基因轉(zhuǎn)染組細(xì)胞對(duì)順鉑和紫杉醇的敏感性顯著增高，上

8、述耐藥相關(guān)基因和凋亡抑制基因的表達(dá)水平則明顯降低；(8)特異性信號(hào)阻斷劑PD98059和Wortmannin能以劑量依賴的方式分別阻斷由外源性IL-6或內(nèi)源性過(guò)表達(dá)IL-6誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑和紫杉醇產(chǎn)生的耐藥。
　　 結(jié)論：(1)卵巢癌細(xì)胞通過(guò)自分泌IL-6可誘導(dǎo)其對(duì)傳統(tǒng)化療藥物順鉑和紫杉醇產(chǎn)生耐藥性；(2)IL-6誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞產(chǎn)生化療耐藥的作用可能與上調(diào)耐藥相關(guān)基因MDR1、GST-π和凋亡抑制基因Bcl-2、Bcl-x