LPLUNC1抑制NF-κB和Stat3信號(hào)通路的激活抵抗促炎因子IL-6促進(jìn)的鼻咽癌發(fā)生發(fā)展.pdf

1、[研究背景]
　　 慢性炎癥是腫瘤的第七大生物學(xué)特征，慢性炎癥在觸發(fā)腫瘤發(fā)生、促進(jìn)腫瘤發(fā)展中起著非常重要的作用;炎癥誘導(dǎo)的腫瘤稱為炎癥相關(guān)性腫瘤。鼻咽癌是一種具有明顯地區(qū)差異的惡性腫瘤。鼻咽由于生理和解剖位置的特性，鼻咽上皮細(xì)胞時(shí)刻受到各種外源病原微生物如EBV和有毒化學(xué)物質(zhì)等損害，使得鼻咽粘膜保護(hù)機(jī)制容易被破壞，極易導(dǎo)致鼻咽慢性炎癥，因而有利于誘導(dǎo)鼻咽癌發(fā)生發(fā)展，因此鼻咽癌也是一種炎癥相關(guān)性腫瘤。然而，鼻咽慢性炎癥如何誘發(fā)鼻咽

2、癌發(fā)生發(fā)展，尤其是在此過程中激活的免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、鼻咽上皮細(xì)胞充當(dāng)何種角色，目前不是很清楚。LPLUNC1基因是我室克隆的鼻咽癌表達(dá)下調(diào)的基因?，F(xiàn)有研究表明LPLUNC1基因編碼的蛋白是一種分泌性蛋白，大量存在于鼻咽和呼吸道分泌物、灌洗液和痰液中;LPLUNC1蛋白可借助其BPI結(jié)構(gòu)域行使宿主防御功能，具有殺菌抗炎的作用，而BPI結(jié)構(gòu)域可以抑制腫瘤生長與轉(zhuǎn)移。因此，我們對(duì)LPLUNC1基因在鼻咽慢性炎癥促進(jìn)鼻咽癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用

3、及其相關(guān)分子機(jī)制進(jìn)行了探討。
　　 [炎癥因子刺激鼻咽癌上皮細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)]
　　 為盡可能的獲取炎癥時(shí)各種促炎因子，我們用低濃度LPS(10ng/ml，近似于細(xì)菌脂多糖的生理濃度，如細(xì)菌感染時(shí))刺激巨噬細(xì)胞，qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)低濃度LPS可明顯上調(diào)促炎因子TNF-α、IL-6、IL-Iβ和IL-8基因表達(dá)，ELISA檢測(cè)顯示在巨噬細(xì)胞上清培養(yǎng)液中含有大量的促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-8。因此，

4、為能更好的在體外模擬炎癥環(huán)境，反映慢性炎癥時(shí)鼻咽癌細(xì)胞的狀態(tài)，我們收集低濃度LPS刺激和未刺激巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清作為條件培養(yǎng)基（分別以D-THP-LPS，D-THP表示）處理鼻咽癌5-8F細(xì)胞，檢測(cè)促炎因子對(duì)5-8F細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示，無論在mRNA水平還是蛋白水平，鼻咽癌5-8F細(xì)胞經(jīng)D-THP-LPS條件培養(yǎng)基處理24小時(shí)后，細(xì)胞中促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-8表達(dá)明顯增加，D-THP-LPS條件培養(yǎng)基可促進(jìn)鼻咽

5、癌5-8F細(xì)胞增殖，激活NF-κB和Stat3信號(hào)通路。說明炎癥微環(huán)境下鼻咽癌上皮細(xì)胞可因炎性因子的刺激而激活NF-κB和Stat3信號(hào)通路，自分泌促炎因子，維持和擴(kuò)大局部炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)鼻咽癌發(fā)生發(fā)展。
　　 [IL-6促進(jìn)鼻咽癌發(fā)生發(fā)展]
　　 促炎因子IL-6是腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）分泌的主要促炎因子之一，在炎癥促腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中具有很重要的作用，而目前IL-6和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）對(duì)鼻咽癌發(fā)生發(fā)

6、展的影響不是很清楚。因此我們檢測(cè)分析了鼻咽癌組織中IL-6蛋白表達(dá)情況和TAMs浸潤程度，IL-6對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生長的影響。采用鼻咽癌組織芯片，免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)鼻咽癌組織中IL-6和CD68（TAMs分子標(biāo)記物，表達(dá)強(qiáng)弱可以反映TAMs在腫瘤組織中浸潤程度）均呈強(qiáng)陽性表達(dá)，IL-6蛋白表達(dá)與TAMs浸潤密度正相關(guān)，Kaplan-Meier生存分析顯示IL-6蛋白表達(dá)越高或者TAMs浸潤密度越高，鼻咽癌患者預(yù)后越差;外源IL-6可促進(jìn)鼻咽癌

7、細(xì)胞增殖、加快細(xì)胞周期演進(jìn)，同時(shí)免疫熒光、熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)及Western blot檢測(cè)顯示IL-6可激活NF-κB p65和p-Stat3蛋白。由此說明鼻咽癌組織中TAMs浸潤和IL-6蛋白表達(dá)與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，IL-6可通過激活NF-κB和Stat3蛋白促進(jìn)鼻咽癌發(fā)生發(fā)展。
　　 [LPLUNC1基因抑制鼻咽癌細(xì)胞生長]
　　 前期研究顯示LPLUNC1基因在鼻咽癌組織中低表達(dá)，可能是鼻咽癌潛在的抑瘤基因。應(yīng)

8、用鼻咽癌組織芯片，免疫組織化學(xué)檢測(cè)我們發(fā)現(xiàn)LPLUNC1蛋白在正常鼻咽上皮和腺體中高表達(dá)，而在大多數(shù)鼻咽癌組織中低表達(dá)或陰性表達(dá)，LPLUNC1蛋白表達(dá)下調(diào)與鼻咽癌臨床進(jìn)展分期正相關(guān)，Kaplan-Meier生存顯示LPLUNC1蛋白陽性表達(dá)的鼻咽癌患者臨床預(yù)后明顯好于陰性表達(dá)患者，生長曲線繪制、MTT及裸鼠成瘤等實(shí)驗(yàn)均顯示LPLUNC1基因可明顯抑制鼻咽癌細(xì)胞生長與增殖;流式細(xì)胞和凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LPLUNC1基因可引起鼻咽癌細(xì)胞G0/G

9、1期阻滯和誘導(dǎo)凋亡;進(jìn)一步研究顯示，LPLUNC1基因可通過抑制鼻咽癌細(xì)胞NF-κB和Stat3信號(hào)傳導(dǎo)通路，下調(diào)CDK4、cyclin D1、Bcl-2基因表達(dá)，上調(diào)p21、Bax基因表達(dá)。隨后我們分別使用Jak2和NF-κB特異性抑制劑(AG490、BAY11-7082)分別阻斷HNE2/Vector、HNE2/LPLUNC1細(xì)胞中Stat3和NF-κB信號(hào)通路，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AG490、BAY11-7082均能明顯抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖，而

10、LPLUNC1基因與各抑制劑之間具有明顯的協(xié)同作用。上述結(jié)果表明LPLUNC1基因可抑制NF-κB和Stat3信號(hào)通路的激活，引起G0/G1期阻滯和誘導(dǎo)凋亡，從而抑制鼻咽癌細(xì)胞生長。
　　 [LPLUNC1抑制IL-6介導(dǎo)的NF-κB和Stat3信號(hào)通路的激活]
　　 我們研究顯示IL-6可通過激活NF-κB和Stat3促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞生長;組織芯片免疫組化結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)鼻咽癌組織中LPLUNC1蛋白表達(dá)與IL-6蛋白表達(dá)和

11、TAMs浸潤密度明顯負(fù)相關(guān)，同時(shí)應(yīng)用激光捕獲顯微切割技術(shù)分離獲得純化鼻咽癌和正常鼻咽上皮組織，qRT-PCR檢測(cè)也證實(shí)鼻咽癌組織中LPLUNC1 mRNA表達(dá)與IL-6 mRNA表達(dá)明顯負(fù)相關(guān)，提示LPLUNC1可能參與炎癥反應(yīng)，具有抑制IL-6分泌和TAMs浸潤的作用。因此，我們探討了LPLUNC1對(duì)IL-6促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞增殖的影響。首先我們確證了LPLUNC1可明顯抑制LPS誘導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌促炎因子如TNF-α、IL-

12、6、IL-1β和IL-8，參與抗炎反應(yīng);隨后研究發(fā)現(xiàn)，LPLUNC1基因可明顯抑制IL-6對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的促增殖和加速細(xì)胞周期演進(jìn)的作用，熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)盡管HNE2細(xì)胞受到IL-6的刺激，LPLUNC1基因仍可明顯抑制NF-κB和Stat3的轉(zhuǎn)錄活性，免疫熒光檢測(cè)顯示LPLUNC1基因可明顯抑制IL-6誘導(dǎo)的NF-κB p65和Stat3活化入核，Westemblot檢測(cè)也顯示LPLUNC1基因可明顯抑制IL-6誘導(dǎo)的NF-κ3

13、 p65和p-Stat3蛋白表達(dá)，NF-κB p65蛋白表達(dá)減少的同時(shí)伴有IKKβ蛋白表達(dá)減少和IκBα蛋白表達(dá)增加，p-Stat3蛋白表達(dá)減少的同時(shí)伴有p-Jak2蛋白表達(dá)減少，LPLUNC1基因還可通過抑制IL-6介導(dǎo)的NF-κB和Stat3信號(hào)通路的激活，下調(diào)cyclin D1、Bcl-2基因表達(dá)，上調(diào)p21、Bax基因表達(dá)。因此，LPLUNC1基因可通過抑制IL-6介導(dǎo)的NF-κB和Stat3信號(hào)通路的激活，抵抗促炎因子IL-6

14、對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。
　　 [LPLUNC1對(duì)鼻咽癌5-8F細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)譜的影響]
　　 蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)中生物學(xué)功能的真正執(zhí)行者、生命現(xiàn)象的直接體現(xiàn)者，探討生命活動(dòng)中尤其是病理過程中發(fā)生改變的蛋白質(zhì)分子具有重大意義。因此，為進(jìn)一步了解LPLUNC1在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用，我們采用熒光差異凝膠電泳(2D-DIGE)和質(zhì)譜分析技術(shù)獲得了鼻咽癌5-8F細(xì)胞過表達(dá)LPLUNC1基因前后的差異蛋白質(zhì)變化。共鑒定出44

15、個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，包括上調(diào)19個(gè)，下調(diào)25個(gè)。這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)按其功能分類主要是(1)分子伴侶蛋白;(2)細(xì)胞骨架蛋白;(3)參與細(xì)胞新陳代謝的酶類或蛋白;(4)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子;(5)其他蛋白。結(jié)果表明LPLUNC1基因可能通過調(diào)控上述蛋白分子表達(dá)參與細(xì)胞代謝、增殖、轉(zhuǎn)錄以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過程，從而影響鼻咽癌的生長。隨后，我們對(duì)上調(diào)差異蛋白Prohibitin（PHB）、下調(diào)差異蛋白hypoxia up-regulated1 prec

16、ursor(HYOU1)和calreticulinprecursor variant(CALR)進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果顯示，LPLUNC1基因轉(zhuǎn)染5-8F細(xì)胞前后上述差異蛋白質(zhì)表達(dá)確實(shí)存在差異，與質(zhì)譜鑒定結(jié)果一致;對(duì)Prohibitin蛋白進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Prohibitin蛋白在正常鼻咽組織中呈高表達(dá)，而在絕大部分鼻咽癌組織中呈低表達(dá)，Prohibitin蛋白表達(dá)降低與鼻咽癌的臨床進(jìn)展分期和轉(zhuǎn)移相關(guān)，Kaplan-Meier生存分析和多因素