JAK-STAT信號(hào)通路在胰彈性蛋白酶誘導(dǎo)大鼠Kupffer細(xì)胞分泌促炎因子中的作用.pdf

1、急性胰腺炎（Acute pancreatitis，AP）是一種多系統(tǒng)疾病，是臨床常見急腹癥之一，不但累及胰腺，而且累及肝、肺、腎臟等器官，早期死亡的主要原因是AP合并多器官功能衰竭，其住院病人死亡率高達(dá)25%。由于胰腺血液在回流心臟前需經(jīng)過肝臟的代謝和處理，而肝臟的Kupffer細(xì)胞（Kupffercell，KC）占整個(gè)單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的80%～90%，是體內(nèi)最大的固定巨噬細(xì)胞群，因此肝臟是AP最常累及的胰外器官之一，其對(duì)AP的病情發(fā)展

2、也有重要影響。而且，肝功能損害已被認(rèn)為是判斷AP嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)，已作為獨(dú)立的指標(biāo)合并進(jìn)了預(yù)測AP嚴(yán)重程度的Ranson評(píng)分和急性生理慢性健康評(píng)估Ⅱ（Acute Physiological Chronic Health EvaluationⅡ，APACHE Ⅱ）系統(tǒng)，對(duì)預(yù)測AP臨床預(yù)后尤為重要。 關(guān)于AP時(shí)并發(fā)多器官功能不全綜合征（Multiple organ dysfunction syndrome，MODS）的發(fā)病機(jī)制存在

3、眾多理論，除胰酶異常激活、微循環(huán)障礙、腸道細(xì)菌易位、內(nèi)毒素血癥及二次打擊學(xué)說外，炎癥介質(zhì)過度表達(dá)理論目前已經(jīng)成為又一研究難點(diǎn)及熱點(diǎn)。許多研究表明炎癥因子在AP的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。在細(xì)胞水平，細(xì)胞因子的作用能被協(xié)同，拮抗或互補(bǔ)，表明在促炎和抗炎刺激下存在復(fù)雜的相互作用。AP時(shí)，胰腺腺泡細(xì)胞凋亡、胰酶大量釋放，胰酶及胰腺壞死產(chǎn)物迅速誘導(dǎo)氧自由基釋放，活化核因子-kappaB（NF-kB），并隨之產(chǎn)生大量促炎細(xì)胞因子如TNF-α，IL

4、-1，IL-6及IL-18等，引起細(xì)胞黏附分子上調(diào)和白細(xì)胞活化以及許多其他遞質(zhì)爆發(fā)等一系列連鎖和放大反應(yīng)，這些細(xì)胞因子的大量釋放，各種效應(yīng)細(xì)胞活化，最終導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征（Systemic inflammatory response syndrome，SIRS）以及MODS。 JAK/STAT（Janus Kinases/signal transducers and activators of transcription）

5、信號(hào)通路途徑最初是在1994年，Darnell等進(jìn)行干擾素（IFN-α和IFN-γ）對(duì)細(xì)胞的作用機(jī)制研究時(shí)發(fā)現(xiàn)的，它代表的是一條極其快速的從細(xì)胞外到細(xì)胞核的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，環(huán)節(jié)少而簡潔。多種細(xì)胞因子可與細(xì)胞表面受體結(jié)合，誘導(dǎo)受體二聚化，并通過酪氨酸磷酸化作用激活JAK，活化的JAKS可使受體的酪氨酸結(jié)合位點(diǎn)磷酸化，當(dāng)細(xì)胞受到信號(hào)刺激時(shí)，SH2結(jié)構(gòu)域與受體上磷酸化的酪氨酸殘基相結(jié)合，磷酸化的STATS從受體上解離下來進(jìn)入核內(nèi)，與DNA靶序列

6、特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)相應(yīng)基因表達(dá)，完成細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)全過程。近年來有有研究表明，JAK/STAT信號(hào)通路參與了多種重要致炎、抗炎細(xì)胞因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)控過程，尤其以IFN-r、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10以及近年新發(fā)現(xiàn)的促炎癥因子IL-18與JAK/STAT信號(hào)通路活化關(guān)系密切。業(yè)已明確，IFN-r是膿毒癥時(shí)重要的炎癥介質(zhì)，脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）合并IFN-r攻擊時(shí)小鼠致死率明顯升高，其

7、原因可能與IFN-r活化JAK/STAT信號(hào)通路有關(guān)。然而，關(guān)于JAK/STAT信號(hào)通路在AP大鼠肝臟KC分泌促炎性因子中的作用，目前尚無研究報(bào)道。 基于此，本研究將通過體外實(shí)驗(yàn)建立AP模型，利用ELISA、細(xì)胞免疫熒光技術(shù)、Western blot等技術(shù)研究實(shí)驗(yàn)性AP大鼠肝臟KC中JAK/STAT活化、TNF-α、IL-6及IL-18的表達(dá)，并通過JAK2特異性抑制劑AG490進(jìn)行干預(yù)性研究，選擇性地阻斷JAK從而阻斷JAK/

8、STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)闡明JAK/STAT信號(hào)通路、細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)之間的相互作用關(guān)系及調(diào)控機(jī)制，以從分子水平闡明AP肝損傷的發(fā)病機(jī)制，為AP臨床治療提供一個(gè)新的思路。 目的: 以AP肝損傷作為研究對(duì)象，通過原代細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)肝臟KC表達(dá)的炎癥細(xì)胞因子在JAK2/STAT信號(hào)通路中的作用，以及JAK2抑制劑對(duì)AP肝損傷的保護(hù)作用，以期對(duì)AP病程中胰外器官損傷發(fā)生率高、病死率高的原因，及其與SIRS之間的相互關(guān)系進(jìn)行初步探討，為臨床最終

9、達(dá)到提高AP療效、減少AP并發(fā)癥、降低其病死率提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 材料和方法: 健康雄性SD大鼠24只（200～250g），購自南京軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。本實(shí)驗(yàn)按采用改進(jìn)了的酶消化、密度梯度離心以及選擇貼壁法提取KC。將提取的KC接種于6孔板中（1×10/ml），1h后去除培養(yǎng)基，再用溫PBS清洗2遍，去除未貼壁細(xì)胞，貼壁細(xì)胞即為實(shí)驗(yàn)所需的高純度的KC，繼續(xù)用10%FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h后，按

10、隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分成細(xì)4組，A組：在培養(yǎng)基上清液中加入生理鹽水（30ul/ml）作為正常對(duì)照組；B組：上清液LPS（50ng/ml）處理組；C組：LPS（50ng/ml）和elastase（1U/ml）處理組；D組：AG490預(yù)處理組：AG490（30nmol/ml）預(yù)先刺激0.5h后，再用LPS（50ng/ml）和elastase（1U/ml）處理，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。各組細(xì)胞置于相同條件下培養(yǎng)，12h后收集培養(yǎng)基，4℃，10000×g離心

11、10min，取上清液并立即凍于-70℃保存；同時(shí)收集KC，提取蛋白并定量。分別用ELISA試劑盒檢測細(xì)胞上清液IL-6、IL-18和TNF-α含量和用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)和Western blotting法檢測細(xì)胞總蛋白中JAK2的表達(dá)情況。 本研究所有計(jì)量資料以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS13.0軟件，計(jì)量資料采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果: 1.A、B、C、D四

12、組總的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.000）。與A組比較，B組TNF-α，IL-6和IL-18含量均顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.000）；與B組比較，C組TNF-α，IL-6和IL-18含量均顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.000）；與C組比較，D組TNF-α，IL-6和IL-18含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.000），但與B組比較僅有輕微變化，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。 2.熒光顯微鏡下觀察細(xì)

13、胞發(fā)綠色熒光情況。未作處理的KC未檢測到熒光染色的細(xì)胞；B組可見JAK2表達(dá)微弱；給與LPS和elastase處理后，JAK2表達(dá)上調(diào)；D組給與AG490預(yù)處理后，JAK2表達(dá)明顯下調(diào)。 3.各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組KC中均有JAK2表達(dá)。A、B、C、D四組總的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.000）。給與LPS刺激后，JAK2含量與對(duì)照組比較增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.000）；同時(shí)給予LPS和elastase刺激后，與B組相比較

14、JAK2含量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.000）；給予AG490預(yù)處理后，JAK2含量與C組比較減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.000），但與B組比較僅有輕微變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.928）。 主要結(jié)論: 1.AP病程中，KC在炎癥反應(yīng)放大、胰外器官損傷中起著重要的作用。 2.KC受到胰彈性蛋白酶等胰酶及LPS的刺激后誘導(dǎo)炎癥因子的大量表達(dá)，激活JAK2/STAT信號(hào)通路，在炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展過程中

15、發(fā)揮著重要作用，可能是導(dǎo)致SIRS和高M(jìn)ODS發(fā)生率、高病死率的原因。 3.胰彈性蛋白酶等胰酶刺激KC后，IL-6、IL-18和TNF-α等炎癥因子的表達(dá)顯著增加，這表明AP病程中炎癥反應(yīng)較其它疾病更易被異常放大的原因可能與胰彈性蛋白酶等胰酶的存在和大量釋放有關(guān)。 4.AG490可顯著減少胰彈性蛋白酶等胰酶及LPS的刺激后誘導(dǎo)的炎癥因子的產(chǎn)生，其可能是通過抑制JAK2的活化，有效阻斷其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)導(dǎo)激活子STAT的活