異體牙周膜干細胞移植與機體體液(B細胞)免疫應答研究.pdf

1、牙齒缺失修復及牙周組織再生是口腔科學的工作和研究中心之一，目前臨床上對牙周炎致骨缺損的治療仍然是一個難題，而利用義齒包括固定義齒、活動義齒和種植義齒等修復是一類贗復體修復，缺乏真正意義上的生物修復。近年來，關于牙齒干細胞及組織工程技術的研究進展給牙齒和牙周組織生物再生帶來了新的希望。諸多研究提示牙齒相關干細胞是牙齒再生和牙周組織再生的最佳種子細胞來源，具有較廣闊的臨床應用前景。然而，自體牙齒干細胞來源有限，如果牙齒干細胞能異體應用，就能

2、明顯擴大牙齒再生種子細胞來源，極大推進牙齒和牙周組織再生的發(fā)展。機體的免疫分為細胞免疫和體液免疫兩部分，本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)牙齒相關干細胞不會引起細胞免疫應答，但是牙齒相關干細胞對機體體液免疫應答（B淋巴細胞）的影響尚不清楚。為了同種異體牙周膜干細胞能夠將來安全地用于臨床，本研究擬探討牙周膜干細胞對同種異體B淋巴細胞功能的影響，并利用小型豬模型，觀察牙周膜干細胞異體移植修復牙周炎骨缺損的能力及有無體液免疫排斥。本研究包括以下三個部分:

3、
　　第一部人牙周膜干細胞的培養(yǎng)與鑒定
　　目的:分離培養(yǎng)及鑒定人牙周膜干細胞，為下一步對牙周膜干細胞的其他性能進行研究提供必要的基礎和前提。方法:選取首都醫(yī)科大學附屬北京口腔醫(yī)院口腔頜面外科門診拔除阻生第三磨牙的患者，無菌條件下剝離牙根外牙周組織，參照以往關于人牙齒相關干細胞的培養(yǎng)方法及條件，分離培養(yǎng)人牙周膜干細胞，并通過倒置顯微鏡、流式細胞儀等對其生長特性、誘導分化能力，表面標志物進行觀察。
　　結果:原代培養(yǎng)的人

4、牙周膜干細胞生長良好，呈梭性。牙周膜干細胞的克隆形成率為（15-28個/105）。流式細胞儀結果顯示，分離培養(yǎng)的牙周膜干細胞中的STRO-1，CD146，CD90，SSEA-4，OCT-4，其表達陽性率分別為13.34±1.83％，80.61％±5.41％，98.67％±1.03％，88.67％±4.03％，95.33％±4.53％。經誘導分化后，牙周膜干細胞在體外有誘導分化成骨和成脂肪的能力。
　　結論:人牙周膜干細胞可在體外成

5、功培養(yǎng)，表現(xiàn)出良好的生長狀態(tài)，并有橫向分化的潛能。
　　第二部分人牙周膜干細胞對同種異體B淋巴細胞的影響
　　目的:在體外研究人牙周膜干細胞對同種異體B淋巴細胞功能的影響。
　　方法:正常人外周血的B淋巴細胞與人牙周膜干細胞共培養(yǎng)，通過對B淋巴細胞增殖、凋亡、分化、趨化、分泌功能和共刺激分子表達的檢測，從而研究牙周膜干細胞對B淋巴細胞功能的影響，同時用hBMSCs作同型對照，并通過Transwell實驗，CBA、抗體中

6、和實驗等來研究牙周膜干細胞影響B(tài)淋巴細胞增殖和凋亡的可能機制。
　　結果:經流式細胞術檢測，牙周膜干細胞抑制由CpG ODN、rCD40L、Anti-immunoglobulin(IgA+IgG+IgM)、IL-2和IL-4引起的B淋巴細胞增殖，且這種抑制具有濃度依賴性;延遲加入牙周膜干細胞也能抑制由上述刺激所引起的B淋巴細胞增殖。本研究還發(fā)現(xiàn)，牙周膜干細胞對B淋巴細胞表面的共刺激分子(CD40、CD80、CD86和HLA DR)

7、的表達和分泌功能不產生影響，但對B淋巴細胞的分化和趨化功能有抑制作用。通過Transwell實驗發(fā)現(xiàn):牙周膜干細胞抑制B淋巴細胞增殖的機制可能是通過細胞接觸和可溶性分子共同作用。通過流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn):共培養(yǎng)后，牙周膜干細胞表面PD-1、PD-L1和PD-L2表達發(fā)生改變;進一步利用抗體中和實驗證明，牙周膜干細胞可能是通過PD-1和PD-L1來部分抑制B淋巴細胞增殖。凋亡實驗表明，牙周膜干細胞并非通過促進B淋巴細胞凋亡來發(fā)揮免疫抑制作用

8、，相反，牙周膜干細胞通過分泌IL-6抑制B淋巴細胞的凋亡。
　　結論: hPDLSCs和hBMSCs類似，能夠抑制B淋巴細胞的增殖，而且這種抑制作用呈濃度依賴性;hPDLSCs對B細胞的分化、趨化功能也有抑制作用，但對B細胞的抗原提呈功能和分泌功能無明顯影響:hPDLSCs通過分泌IL-6抑制B淋巴細胞的凋亡;hPDLSCs通過PD-1及PD-L1部分抑制B淋巴細胞的增殖，與B淋巴細胞的凋亡無關。
　　第三部分小型豬牙周膜干

9、細胞同種異體移植后對機體體液免疫應答的影響
　　目的:在體內研究牙周膜干細胞的異體移植后對機體體液免疫應答的影響。
　　方法:選用雌性五指山小型豬12只，建立牙周炎骨缺損模型，同時分離、培養(yǎng)、擴增五指山小型豬和雄性貴州小型香豬牙周膜干細胞。建模后1個月開始治療，分為4組:(1)空白對照組:建立實驗性牙周炎模型后不做任何處理;(2) HA/TCP組:在建模后做翻瓣刮治+ HA/TCP修復，覆蓋以明膠海綿;(3)自體牙周膜干細胞

10、+HA/TCP組:建模后做翻瓣刮治+自體牙周膜干細胞+ HA/TCP修復，覆蓋以明膠海綿;(4)異體牙周膜干細胞+ HA/TCP組:建模后做翻瓣刮治+雄性貴州小型香豬牙周膜干細胞+ HA/TCP修復，覆蓋以明膠海綿。觀察指標包括臨床觀察（牙周探診深度、附著喪失等）、影像學檢查、血液學檢查、組織學觀察和體液免疫指標等的檢測。
　　結果:成功建立牙周炎模型，各組模型之間無統(tǒng)計學差異;治療后12周，發(fā)現(xiàn)自體牙周膜干細胞組和異體牙周膜干細

11、胞組的牙周指數(shù)（牙齦退縮、牙槽骨缺失和牙周袋深度）與空白對照組、HA/TCP組相比有統(tǒng)計學差異，但治療后自體牙周膜干細胞組和異體牙周膜干細胞組牙周指數(shù)之間無統(tǒng)計學意義。CT掃描發(fā)現(xiàn)，治療后12周，自體牙周膜干細胞組和異體牙周膜干細胞組都有明顯的新生骨質影像，而空白對照組和HA/TCP組卻不明顯。血液學研究表明，無論是治療前還是治療后各個時間點，各治療組的血常規(guī)、血生化、免疫球蛋白和體液免疫學指標(CD20，CD25，B220)都沒有統(tǒng)計

12、學差異，同時檢測齦溝液和牙周組織的免疫球蛋白也沒有統(tǒng)計學差異，說明異體干細胞移植組在治療后無炎性病變產生，無肝腎功能的損傷，無近期或者遠期體液免疫反應產生。組織學觀察表明，在自體牙周膜干細胞組和異體牙周膜干細胞組，都有明顯的牙槽骨、牙骨質和牙周膜再生，骨缺損基本修復，而在空白對照組和HA/TCP組，仍可見明顯的典型牙周炎表現(xiàn)，包括深牙周袋、缺乏新骨和新牙周膜形成。最后通過細胞移植術后1周和2周，對自體移植組和異體移植組的局部牙周組織IL