巨噬細(xì)胞β-arrestin-1及CB2受體在潰瘍性結(jié)腸炎中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、在全世界范圍內(nèi)，潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病呈現(xiàn)越來(lái)越高的趨勢(shì)，在美國(guó)，每年用在治療潰瘍性結(jié)腸炎上的花費(fèi)大概為81-149億美元，而在歐洲，這個(gè)費(fèi)用高達(dá)291億歐元。在我國(guó)，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高，潰瘍性結(jié)腸炎患者的人數(shù)也逐年增多，另外由于潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制并不確切，目前所有的藥物只能控制癥狀而不能徹底治愈，給全社會(huì)和患者帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)。更值得關(guān)注的是，遷延不愈的結(jié)腸炎到最后很有可能發(fā)展為結(jié)腸癌，所以深入挖掘潰瘍性結(jié)腸

2、炎發(fā)生發(fā)展的病理生理機(jī)制，以及尋找新的藥物治療靶點(diǎn)對(duì)于潰瘍性結(jié)腸炎的防治具有至關(guān)重要的意義。為了解決這一問(wèn)題，本課題分為以下兩個(gè)部分進(jìn)行。
　　第一部分：為巨噬細(xì)胞β-arrestin-1在潰瘍性結(jié)腸炎中的表達(dá)調(diào)控及作用研究。文獻(xiàn)報(bào)道，全身敲除β-arrestin-1可以保護(hù)DSS和TNBS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎，而非造血細(xì)胞系β-arrestin-1敲除則加重DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎，說(shuō)明不同細(xì)胞來(lái)源的β-arrestin-1對(duì)結(jié)腸炎的

3、作用是不同的。為了明確造血細(xì)胞系的β-arrestin-1對(duì)腸炎的作用，本課題組利用Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)培育了髓系（巨噬細(xì)胞）β-arrestin-1特異性敲除小鼠(β-arrestin-lfloxp/floxpLysM-Cre)，通過(guò)與野生型小鼠比較，發(fā)現(xiàn)β-arrestin-1floxp/flxpLysM-Cre小鼠對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎耐受性增加，表現(xiàn)為體重下降程度減輕，血便和結(jié)腸組織HE評(píng)分降低，說(shuō)明髓系β-arrestin

4、-1可以促進(jìn)結(jié)腸炎的發(fā)病。接著我們提取了野生型和β-arrestin-1floxp/floxpLysM-Cre小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞，給予TNF-α刺激，發(fā)現(xiàn)β-arrestin-1敲除后，TNF-α誘導(dǎo)的炎癥因子水平降低。進(jìn)一步我們通過(guò)Western blot，免疫熒光和EMSA對(duì)β-arrestin-1促進(jìn)巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的機(jī)制進(jìn)行了探索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，β-arrestin-1可以促進(jìn)TNF-α引起的巨噬細(xì)胞NF-κB和MAPK通路的活

5、化，此外，免疫共沉淀表明，β-arrestin-1可以直接與NF-κB通路上的IKK和IκBα結(jié)合。另外，在DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型中，我們發(fā)現(xiàn)β-arrestin-1的水平增加，同時(shí)在RAW264.7和體外培養(yǎng)的腹腔巨噬細(xì)胞中，TNF-α刺激也可以導(dǎo)致β-arrestin-1表達(dá)增加。為了明確β-arrestin-1的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，我們利用雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)，發(fā)現(xiàn)NF-κB可能介導(dǎo)了β-arrestin-1的基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步利用

6、NF-κB活化抑制劑BAY11-7082證實(shí)了NF-κB確實(shí)能夠調(diào)控β-arrestin-1的表達(dá)。通過(guò)這一部分實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞β-arrestin-1可以通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)NF-κB和MAPK通路的活化來(lái)增加炎癥因子的表達(dá)，從而伎結(jié)腸炎加重，同時(shí)在結(jié)腸炎發(fā)生時(shí)，巨噬細(xì)胞又可以通過(guò)NF-κB調(diào)控β-arrestin-1的表達(dá)，本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞特異性角度出發(fā)的思路可能會(huì)為潰瘍性結(jié)腸炎的治療策略提供新的研究方向。
　　第二部分：為激

7、活Ⅱ型大麻素(Cannabinoid receptor2，CB2)受體保護(hù)潰瘍性結(jié)腸炎的機(jī)制研究。激活CB2受體可以產(chǎn)生抗炎作用，例如我們實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)發(fā)表的一篇文章揭示在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型中，激動(dòng)CB2受體可以減少滑膜細(xì)胞炎癥因子的產(chǎn)生，并且抑制滑膜細(xì)胞的增生，降低關(guān)節(jié)中骨的破壞和白細(xì)胞的浸潤(rùn)，從而減輕關(guān)節(jié)炎的癥狀。自噬是細(xì)胞內(nèi)一種重要的保護(hù)機(jī)制，通過(guò)降解物質(zhì)可以為細(xì)胞提供能量，殺滅病原體可以使細(xì)胞免受侵害，其在細(xì)胞增殖，分化和死亡過(guò)程中

8、發(fā)揮著重要作用;自噬能夠降低過(guò)度激活的炎癥免疫反應(yīng)，因此參與多種疾病如腫瘤、感染、神經(jīng)退行性病變和炎癥的調(diào)控。在前期的工作中，本課題組發(fā)現(xiàn)激活CB2受體可以增加小膠質(zhì)細(xì)胞（BV2細(xì)胞）的自噬，抑制NLRP3炎性小體的活性從而減輕小鼠自身免疫性腦脊髓炎。在這部分實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)給小鼠腹腔注射CB2受體激動(dòng)劑HU308可以明顯改善DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥狀，而CB2受體敲除小鼠對(duì)DSS的敏感性增加，結(jié)腸炎癥狀更嚴(yán)重。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，激活CB2受

9、體，小鼠結(jié)腸組織和巨噬細(xì)胞內(nèi)的NLRP3生成減少，前體Caspase-1轉(zhuǎn)化為活性Caspase-1的水平也降低，同時(shí)前體IL-1β生成減少，而自噬相關(guān)蛋白Beclin-1，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平增加，SQSTM1減少;與野生型相比，CB2受體敲除導(dǎo)致小鼠結(jié)腸和巨噬細(xì)胞表達(dá)更多的NLRP3和前體IL-1β，且前體Caspase-1轉(zhuǎn)化為活性Caspase-1增多，而自噬水平降低。為了明確自噬在CB2受體抑制NLRP3炎性小體中發(fā)揮的

10、作用，我們用自噬相關(guān)基因5(autophagy targetedgene，Atg5)的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)干擾掉RAW264.7的自噬過(guò)程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Atg5 siRNA部分取消了CB2受體激動(dòng)劑HU308對(duì)NLRP3炎性小體的抑制作用，同時(shí)小鼠體內(nèi)給予自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)也削弱了HU308對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的保護(hù)作用和對(duì)NLRP3炎性小體的抑制效果。最后，我們檢測(cè)了自噬