PRS-CTGF-siRNA對(duì)高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞CTGF及細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的影響.pdf

1、腎小管間質(zhì)纖維化(tubulointerstitial fibrosis，TIF)幾乎是所有慢性腎臟疾病進(jìn)行性發(fā)展的共同通路。與腎功能惡化密切相關(guān)，是進(jìn)展性腎病的主要病理特征。研究表明，多種細(xì)胞因子參與調(diào)節(jié)TIF，其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor，TGF)-β起到中樞作用。但TGF-β生物學(xué)效應(yīng)復(fù)雜，完全阻斷其表達(dá)并不現(xiàn)實(shí)。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth fact

2、or，CTGF)是TGF-β介導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化的重要下游效應(yīng)因子，成為抗纖維化治療新的靶點(diǎn)。 19-29核苷酸的小分子干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞能特異性的降解靶mRNA，導(dǎo)致基因沉默。病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是目前介導(dǎo)DNA或RNA片段轉(zhuǎn)移最有效的方法。因此使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)siRNA阻斷CTGF表達(dá)或抑制其活性，可能是一種更特異、更有效地防治腎纖維化的手段。

3、本研究在體外觀察高糖對(duì)人近曲小管上皮細(xì)胞(HKC)表達(dá)CTGF，Ⅰ型膠原(collagen Ⅰ，col Ⅰ)，纖維粘連蛋(fibronectin，F(xiàn)N)等的影響，以及構(gòu)建的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PRS介導(dǎo)的結(jié)締組織生長(zhǎng)因子siRNA(命名為PRS-CTGF-siRA高糖誘導(dǎo)效應(yīng)的抑制作用。 方法:(1)構(gòu)建表達(dá)人CTGF siRNA的PRS-CTGF-siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體；(2)體外培養(yǎng)HKC，用不同濃度D-葡萄糖(5.5，30，6

4、0mM)刺激細(xì)胞48h；選取30mM D-葡萄糖作用于細(xì)胞不同的時(shí)間點(diǎn)(0，12，24，48，72h)，用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)及Western blot方法檢測(cè)HKC中CTGFmRNA和蛋白表達(dá)水平的時(shí)間和濃度效應(yīng)；(3)選取高糖(30mM，48h)刺激HKC，觀察逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PRS介導(dǎo)的結(jié)締組織生長(zhǎng)因子siRNA對(duì)HKC的影響。實(shí)驗(yàn)分組如下：①對(duì)照組(含5.5mM D-葡萄糖的無(wú)血清DMEM培養(yǎng))；②高糖組(用含30

5、mM D-葡萄糖的無(wú)血清DMEM培養(yǎng))；③高糖+siRNA組(用含30mM D-葡萄糖的無(wú)血清DMEM對(duì)PRS-CTGF-siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒液感染后的穩(wěn)定細(xì)胞培養(yǎng))；④高糖+PRS組(用含30mM D-葡萄糖的無(wú)血清DMEM對(duì)空載體PRS逆轉(zhuǎn)錄病毒液感染后的穩(wěn)定細(xì)胞培養(yǎng))；⑤代謝滲透壓對(duì)照組(含24.5mM甘露醇無(wú)血清DMEM培養(yǎng))。用RT-PCR測(cè)定CTGF,colI，F(xiàn)N mRNA的表達(dá)效應(yīng)，western blot方法測(cè)定col

6、I,CTGF蛋白水平的影響。每組重復(fù)實(shí)驗(yàn)5次，取3次結(jié)果計(jì)算，以平均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示。 結(jié)果：經(jīng)酶切與測(cè)序證實(shí)PRS-CTGF-siRNA構(gòu)建成功；高糖以劑量依賴(lài)和時(shí)間依賴(lài)方式上調(diào)HKC中CTGFmRNA表達(dá)；在高糖(30mM，48h)刺激下，colI，F(xiàn)N mRNA表達(dá)量亦顯著增加(P<0.01)，PRS-CTGF-siRNA能可顯著抑制HKC CTGF,FN和colI mRNA表達(dá)的增加(p<0.01)，亦可明顯抑制胞內(nèi)CTG