波動性高糖誘導腎小管上皮細胞凋亡及其機制研究.pdf

1、目的:建立糖尿病(diabetes mellitus，DM)大鼠血糖波動模型，探討血糖波動引起腎小管上皮細胞凋亡的機制。
　　方法:雄性SD大鼠隨機均分為3組，N組為正常對照組，D組為穩(wěn)定高血糖組，F組為波動高血糖組，各組10只。D組、F組均一次性腹腔內注射STZ65mg/kg，測空腹血糖＞16.7mmol/L、尿糖+++，提示造模成功;F組每天錯時給予速效胰島素和葡萄糖造成血糖波動模型。F組每天給予胰島素和葡萄糖時，N組和D組均

2、給予等劑量的生理鹽水;F組以12周內每天血糖波動模式相似，且HbA1c與D組無顯著性差異，則說明波動性高血糖造模成功。造模12周后，檢測血生化指標和腎組織原位凋亡、Bax、Bcl-2、P-p53、P-JNK、Nox-4蛋白變化等。
　　結果:
　　1.血糖和HbA1c變化范圍:
　　血糖:N組為(5.40～6.25) mmol/L，D組為(19.15～23.65) mmol/L，F組為(6.17～26.13)mmol/

3、L;HbA1c:N組為(5.10±0.32)％，D組為(10.50±0.69)％，F組為(10.13±0.96)％，D組與F組比較，無明顯統計學差異（P＞0.05）;
　　2.N組體重為(521.67±44.71)g，D組體重為(361.00±106.68)g，F組體重為(254.17±67.69)g，與N組比較，均明顯降低（P＜0.05）;與D組比較，F組減低明顯（P＜0.05）。N組腎指數為(0.34±0.28)，D組腎指數為

4、(0.59±0.88)，F組腎指數為(1.04±0.18)，與N組比較，D組和F組均明顯升高(P＜0.05);與D組比較，F組升高（P＜0.05），有統計學差異。
　　3.與N組比較，D組和F組的S0D活力下降，GSH-Px活力升高和MDA的含量增加(均P＜0.05)，與D組比較，F組的SOD活力顯著下降，GSH-Px活力升高和MDA的含量增加(均P＜0.05)。
　　4.血液膽固醇、甘油三酯、肌酐、尿素氮的結果:與N組比較

5、，D組和F組的血液膽固醇、甘油三酯、肌酐、尿素氮均明顯升高（均P＜0.05）;與D組比較，F組膽固醇、甘油三酯、肌酐、尿素氮均明顯升高（P＜0.05）。與N組比較，D組和F組的24小時尿微量蛋白、尿蛋白定量均明顯升高（均P＜0.05）;與D組比較，F組24小時尿微量蛋白、尿蛋白定量均明顯升高（P＜0.05）。
　　5.光鏡和電鏡下所見:N組腎小球和腎小管未見明顯變化，D組腎小球細胞輕度增多，腎小管有空泡，F組腎小球毛細血管球萎縮、

6、囊腔變大、擴張，明顯分葉，腎小管有空泡、透明樣變，部分壞死脫落。超微結構的變化:F組足突細胞核明顯固縮，基底膜明顯增厚，球內有明顯的充血，近曲小管有明顯的蛋白沉積，遠曲小管上皮細胞固縮、不規(guī)則，電子密度高，染色質多，有凋亡的傾向;而D組足突細胞核輕度固縮，基底膜輕度增厚，近曲小管有少量蛋白沉積，遠曲小管上皮細胞核輕度固縮、細胞器較少。
　　6.免疫組化測定Bcl-2、Bax、Nox-4、P-p53、P-JNK的結果:N組腎小管細胞

7、漿中Bcl-2蛋白表達呈陽性，D組中Bcl-2蛋白表達弱陽性(P＜0.05)，F組表達陰性(P＜0.05);N組腎小管細胞漿中Bax、Nox-4蛋白表達呈陰性或弱陽性，D組中表達呈陽性(P＜0.05)，F組表達呈強陽性（P＜0.05）;而三組腎小球幾乎沒有見到Bax、Nox-4陽性表達。N組腎小球內皮細胞核和腎小管上皮細胞核中P-p53、P-JNK表達陰性，D組表達陽性(P＜0.05)，F組表達強陽性(P＜0.05)。
　　7.腎

8、小球內皮細胞和腎小管上皮細胞凋亡細胞數的結果:N組腎小球內皮細胞和腎小管上皮細胞幾乎未見凋亡，D組可見凋亡，F組腎小球內皮細胞有少量的凋亡細胞，腎小管上皮細胞有大量的凋亡細胞;與N組腎小球內皮細胞凋亡細胞數比較，D組與F組均P＜0.05，與D腎小球內皮細胞凋亡細胞數比較，F組P＞0.05，D組與F組無統計學差異;F組腎小管上皮細胞凋亡細胞數與N組比較P＜0.05，與D組比較P＜0.05。
　　8.Western-blot結果:腎組

9、織磷酸化P53在N組未見表達，D組表達增加，灰度值為1.58±0.18，F組表達比D組增加，灰度值達到1.87±0.75;三組之間比較差異均有統計學意義（P＜0.05）;腎組織磷酸化JNK在N組未見表達，D組表達增加，灰度值為1.33±0.10，F組表達比D組增加，灰度值為1.50±0.72;三組之間比較差異均有統計學意義（P＜0.05）
　　結論:
　　1.波動血糖模型的建立:通過每天錯時給予速效胰島素和50％葡萄糖建造血

10、糖波動模型，12周內每天血糖波動模式相似，且HbA1c與血糖穩(wěn)定組的無顯著性差異，這些指標均達到實驗要求。在12周波動性血糖的大鼠狀態(tài)來看，大鼠消瘦，精神萎靡，反應遲鈍，毛豎無光澤，動作遲緩，弓背蜷體，體重明顯下降。提示血糖波動的糖尿病動物模型制備是成功的。
　　2.波動性高血糖的DM動物血清中的甘油三酯、膽固醇、肌酐和尿素氮及24小時尿微量蛋白、尿蛋白定量都較穩(wěn)定高血糖的糖尿病動物明顯增加，提示波動性高血糖對腎功能的損傷更加嚴重

11、。
　　3.通過形態(tài)學和功能學檢測，發(fā)現波動高血糖較穩(wěn)定高血糖的腎功能下降、腎小管的組織學改變、超微結構改變和細胞凋亡更加明顯，提示波動高血糖較穩(wěn)定高血糖造成更加嚴重的腎臟損傷。
　　4.波動性高血糖時，血清中SOD的含量較穩(wěn)定高血糖時明顯下降，GSH-Px、MDA水平明顯升高，Nox-4蛋白表達明顯增加，提示波動性高血糖較穩(wěn)定高血糖產生更多的活性氧，抗氧化功能明顯下降。
　　5.通過細胞凋亡相關蛋白的檢測，發(fā)現波動高

12、血糖較穩(wěn)定高血糖腎臟的抑凋亡蛋白Bcl-2表達明顯減少，促凋亡蛋白Bax明顯增加，提示血糖波動造成更加嚴重的腎臟細胞凋亡。
　　6.波動高血糖較穩(wěn)定高血糖腎臟的磷酸化的p53蛋白表達明顯增加，且和血清的SOD活力呈負相關性，和GSH-Px活力、MDA含量呈正相關性，和凋亡數呈正相關性，提示磷酸化的p53蛋白參與波動高血糖的腎臟損傷。
　　7.波動性高糖時，由于活性氧在機體內大量的存在，可通過多種途徑引起細胞的損傷和凋亡，其中