IGF-Ⅰ及CTGF對人腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和細(xì)胞外基質(zhì)合成效應(yīng)的體外研究.pdf

1、腎小管間質(zhì)纖維化是多種慢性進(jìn)展性腎臟疾病發(fā)展為終末期腎功能衰竭的共同通路。腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(EMT)作為一種重要的腎間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)制，已得到人們廣泛的關(guān)注。生長因子作為內(nèi)源性信號蛋白對細(xì)胞的增生、分化及功能具有強(qiáng)烈的調(diào)節(jié)作用。他們與細(xì)胞表面高親和性受體結(jié)合后，啟動了多種信號傳導(dǎo)過程，最終誘發(fā)新基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成。近年來生長因子在腎小管間質(zhì)纖維化發(fā)病的作用也越來越受到重視，主要包括轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、胰島素樣生長因子

2、(IGF)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)、表皮生長因子(EGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、血小板源性生長因子(PDGF)等。在先前的研究中，我們已經(jīng)初步證實(shí)CTGF可能作為一種有力的促纖維化的因子在人腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和細(xì)胞外基質(zhì)合成方面起一定的作用，為了加深對CTGF在人腎小管間質(zhì)纖維化方面作用的了解，我們對先前的研究作了進(jìn)一步的深入。同時最近的研究已經(jīng)證實(shí)CTGF和IGF-Ⅰ作為相互促進(jìn)的生長因

3、子在腎小管間質(zhì)纖維化中起重要作用，但是對其機(jī)制了解甚少。CTGF和IGF-Ⅰ是否在EMT中起協(xié)同作用引起了我們的關(guān)注。因此我們選擇IGF-Ⅰ與EMT的關(guān)系研究作為本實(shí)驗(yàn)的一部分，期望其能為CTGF和IGF-Ⅰ在EMT中相互作用的研究作鋪墊。 第一部分胰島素樣生長因子-Ⅰ對人腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和細(xì)胞外基質(zhì)合成的影響 目的：探討胰島素樣生長因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)在人腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和細(xì)胞外基質(zhì)合成中的作用。 方

4、法：將體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細(xì)胞(HK<,2>)分為2組： (1)對照組； (2)IGF-Ⅰ組：培養(yǎng)液中加入IGF-Ⅰ，終濃度分別為25、50、100、200ng/ml。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)測定HK<,2>細(xì)胞E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、角蛋白(Keratin)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、波形蛋白(Vimentin)、纖連蛋白(FN)、膠原Ⅰα和膠原Ⅲα

5、 mRNA水平的變化。ELISA方法檢測培養(yǎng)上清中膠原Ⅰ的濃度。 結(jié)果：IGF-Ⅰ刺激使HK<,2>細(xì)胞形態(tài)由橢圓變?yōu)樗笮?。不同濃度的IGF-Ⅰ作用于HK<,2>細(xì)胞48h后E-cadherin和Keratin mRNA的表達(dá)顯著下降(P<0.05)，α-SMA、Vimentin和FN mRNA水平顯著升高(P<0.01)，且呈劑量依賴性。不同濃度的IGF-Ⅰ作用于HK<,2>細(xì)胞48 h后，膠原Ⅰα和膠原Ⅲα mRNA水平顯著

6、升高(P<0.05)；ELISA結(jié)果顯示，100及200ng/mL IGF-Ⅰ組中HK<,2>細(xì)胞分泌的膠原Ⅰ顯著增加(P<0.05)。 結(jié)論： (1)外源性IGF-Ⅰ在體外能刺激人腎小管上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。 (2)外源性IGF-Ⅰ在體外能刺激人腎小管上皮細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)。 第二部分結(jié)締組織生長因子對人腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和細(xì)胞外基質(zhì)合成的影響 目的：探討外源性結(jié)締組織生長因子(CTG

7、F)在人腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及細(xì)胞外基質(zhì)合成中的作用。 方法：將體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細(xì)胞HK<,2>分為3組：(1)對照組；(2)CTGF小劑量組(終濃度為2.5ng/ml)；(3)CTGF大劑量組(終濃度為20ng/ml)。用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，噻唑藍(lán)(MTT)法檢測細(xì)胞增殖活性，RT-PCR檢測HK<,2>細(xì)胞E-鈣粘蛋白(E-cadher in)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、纖連蛋白(FN)和膠原Ⅰα mR

8、NA水平的變化，免疫組織化學(xué)方法觀察HK<,2>細(xì)胞FN和膠原Ⅰ的表達(dá)。 結(jié)果：CTGF刺激使HK<,2>細(xì)胞由橢圓形變?yōu)樗笮?，同時促進(jìn)HK<,2>細(xì)胞增殖。不同濃度的CTGF作用于HK<,2>細(xì)胞48 h后，α-SMA和FN mRNA水平顯著升高(P<0.05)，E-鈣粘蛋白mRNA的表達(dá)顯著下降(P<0.05)；大劑量CTGF刺激HK<,2>細(xì)胞48 h后膠原ⅠαmRNA水平顯著升高(P<0.05)。小劑量CTGF組HK<,