重組脂聯(lián)素在非酒精性脂肪肝病中作用的初步探討.pdf

1、目的：研究重組AdipoQ基因在真核細胞中的表達情況，利用電穿孔的方法將表達載體導入減毒沙門氏菌并表達，純化蛋白，檢測其在體外對L-02肝細胞脂肪變性的抑制作用，為人AdipoQ在NAFLD的基因治療方面的應用奠定基礎。 方法：（1）從人脂肪組織中提取總RNA，通過RT-PCR方法獲得AdipoQ基因，將其克隆到真核熒光表達載體pEGFP-N1上，構建重組質粒pEGFP-N1-AdipoQ；（2）將重組質粒轉染COS-7細胞，通

2、過報告基因熒光蛋白的表達、RT-PCR和Western blot檢測其融合蛋白在真核細胞中的表達；（3）將重組質粒pEGFP-N1-AdipoQ通過電穿孔的方法導入減毒沙門氏菌并表達；（4）通過亞克隆法構建重組質粒pET32a（+）-AdipoQ，轉化大腸桿菌BL21，以IPTG誘導表達pET32a（+）-AdipoQ融合蛋白。表達產物經Ni-NTA瓊脂糖樹脂純化后，用Western Blot分析；（5）將融合蛋白作用于油酸誘導脂肪變的

3、L-02肝細胞，研究其對肝細胞脂肪變的抑制情況。 結果：（1）通過RT-PCR方法克隆得到AdipoQ基因片斷，長度為744bp，與目的基因片段大小相一致；（2）重組質粒pEGFP-N1-AdipoQ構建成功，AdipoQ在真核細胞中表達，并與熒光蛋白融合； （3）攜帶AdipoQ基因真核表達載體的減毒沙門氏菌株構建成功；（4）純化pET32a（+）-AdipoQ融合蛋白；（5）AdipoQ對油酸誘導脂肪變的L-02肝細