ShRNA下調(diào)CacyBP-SIP基因表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目的：
　　骨肉瘤是一種臨床上常見的原發(fā)惡性骨腫瘤，其發(fā)病率近年來呈逐漸上升趨勢(shì)。目前常規(guī)治療方法為化療-手術(shù)-化療綜合性治療，但其預(yù)后效果較差，五年生存率較低,約為60％-70%。我們急需在骨肉瘤的治療方面取得突破性進(jìn)展，以期為骨肉瘤患者的化療和基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)主要通過shRNA下調(diào)骨肉瘤細(xì)胞株的鈣周期素結(jié)合蛋白（calcyclin binding protein/Siah-1-interacting pr

2、otein， CacyBP/SIP）基因，觀察其對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞株SaOS-2增殖的影響，并探討沉默CacyBP/SIP基因治療骨肉瘤的可行性。
　　方法：
　　1培養(yǎng)U2OS、HOS、MG-63及Saos-2共4種人骨肉瘤細(xì)胞株，應(yīng)用 Real-time quantitative PCR（實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)）方法檢測(cè)CacyBP/SIP在不同骨肉瘤細(xì)胞株中mRNA的表達(dá)豐度。
　　2單獨(dú)培養(yǎng)人骨肉瘤細(xì)胞株Saos-2

3、，應(yīng)用shRNA慢病毒感染目的細(xì)胞，將培養(yǎng)獲得的細(xì)胞分為shCACYBP組（shCACYBP慢病毒感染組）和shCtrl組（陰性對(duì)照病毒感染組）。
　　3 Real-time quantitative PCR方法分別檢測(cè)2組細(xì)胞株中CacyBP/SIP基因mRNA的表達(dá)量，探討shCACYBP慢病毒感染Saos-2細(xì)胞株 knock down效率的影響。
　　4 Western blotting蛋白印跡法檢測(cè)2組細(xì)胞株中Ca

4、cyBP/SIP蛋白質(zhì)的表達(dá)量，比較shRNA慢病毒感染Saos-2細(xì)胞株后對(duì)其CacyBP/SIP蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。
　　5應(yīng)用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)2組細(xì)胞株在細(xì)胞培養(yǎng)板上的克隆形成計(jì)數(shù)，比較shRNA慢病毒感染Saos-2細(xì)胞株后對(duì)其克隆形成能力的影響。
　　6 MTT比色法檢測(cè)2組細(xì)胞株的細(xì)胞活力，比較shRNA慢病毒感染人骨肉瘤細(xì)胞株Saos-2后對(duì)其增殖能力的影響。
　　結(jié)果：
　　1 Real-time

5、quantitative PCR方法檢測(cè) CacyBP/SIP基因在 U2OS、HOS、MG-63及Saos-2的AverageΔCt分別為4.71±0.103、3.56±0.075、3.80±0.070、4.22±0.110，CacyBP/SIP基因在4種骨肉瘤細(xì)胞株中均高豐度表達(dá)。
　　2 Real-time quantitative PCR方法檢測(cè) CacyBP/SIP mRNA在shCACYBP組與shCtrl組中的表達(dá)量

6、，shCACYBP組(0.269±0.014)相較于shCtrl組(1.001±0.060)減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　3 Western blotting蛋白印跡法檢測(cè) shCACYBP組與 shCtrl組中CacyBP/SIP蛋白質(zhì)的表達(dá)，shCACYBP組中CacyBP/SIP蛋白質(zhì)較于shCtrl組表達(dá)減少。
　　4克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)shCACYBP組與shCtrl組中細(xì)胞克隆數(shù)分別為45±8、112±6

7、，shCACYBP組克隆數(shù)與shCtrl組相比減少，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　5 MTT比色法檢測(cè)shCACYBP組與shCtrl組隨著時(shí)間的變化，2組在酶標(biāo)儀對(duì)波長(zhǎng)490nm的光的吸收率及吸收率變化倍數(shù)均增加，與shCtrl組相比shCACYBP組細(xì)胞活力減低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1 CacyBP/SIP在U2OS、HOS、MG-63及Saos-2這4種骨肉瘤細(xì)胞株中均高豐度