多重PCR檢測(cè)水產(chǎn)品中四種食源性致病菌的研究與檢測(cè)試劑盒的開(kāi)發(fā).pdf

1、我國(guó)足水產(chǎn)品的生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó),已成為世界水產(chǎn)品行業(yè)的支柱,而水產(chǎn)品在養(yǎng)殖、捕撈、儲(chǔ)藏、加工、運(yùn)輸、銷(xiāo)售等環(huán)節(jié)容易受到病原微生物的污染,因此病原微生物檢測(cè)是水產(chǎn)品及其加工品衛(wèi)生檢測(cè)中的一項(xiàng)重要工作,其關(guān)系到消費(fèi)者的健康及生命安全。其中沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌和金黃色葡萄球菌被認(rèn)為是重要的污染水產(chǎn)品的致病菌,已引起各個(gè)國(guó)家衛(wèi)生檢測(cè)部門(mén)及疾病控制中心的廣泛重視。我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)DB11/519-2008《生食水產(chǎn)品衛(wèi)生要求》規(guī)定致病菌不

2、得檢出。然而傳統(tǒng)致病菌檢測(cè)方法存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng),一般檢測(cè)周期在5-10天,檢測(cè)程序繁瑣,工作量大等缺點(diǎn),因此亟需建立一種操作簡(jiǎn)便、快速準(zhǔn)確、靈敏度和特異性都較高的現(xiàn)代化檢測(cè)方法,以滿(mǎn)足現(xiàn)代化食品安全快速檢測(cè)的需要。
　　 本研究旨在利用多重PCR技術(shù)系統(tǒng)地建立水產(chǎn)品及其加工制品中沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌和志賀氏菌四種常見(jiàn)食源性致病菌的快速檢測(cè)方法,對(duì)此方法進(jìn)行優(yōu)化和評(píng)價(jià),并基于此方法開(kāi)發(fā)出可用于實(shí)際水產(chǎn)品及其加工制品

3、的目標(biāo)致病菌檢測(cè)的SSSVm-PCR檢測(cè)試劑盒,具體實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　 1.設(shè)計(jì)制備一種能夠同時(shí)富集沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌的復(fù)合共增菌培養(yǎng)基SSSV,用于水產(chǎn)品中上述常見(jiàn)四種食源性致病菌的同時(shí)快速增菌。以緩沖蛋白胨水為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,通過(guò)挑選適合的促進(jìn)劑、抑制劑及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行單岡素試驗(yàn)和正交試驗(yàn),確定其最佳成分及配比;分析了SSSV培養(yǎng)基對(duì)目標(biāo)菌的生長(zhǎng)選擇性及生長(zhǎng)特性,并通過(guò)Gompertz方程構(gòu)建

4、生長(zhǎng)模型,獲得四種目標(biāo)菌在SSSV中的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)率(EGR)、傳代時(shí)間(GT)、停滯期(LPD)及最大菌落密度(MPD)四個(gè)生長(zhǎng)特性參數(shù);通過(guò)人工污染試驗(yàn),分析了SSSV對(duì)不同貯藏條件下的水產(chǎn)品中目標(biāo)致病菌的修復(fù)能力,最后比較了SSSV與營(yíng)養(yǎng)肉湯及國(guó)標(biāo)中各自選擇性增菌液對(duì)實(shí)際水產(chǎn)樣品的檢測(cè)效果。結(jié)果表明,獲得的共增菌培養(yǎng)基SSSV對(duì)非目標(biāo)菌表現(xiàn)出一定的抑制性,能同時(shí)富集不同接種比例組成的混合菌,37℃培養(yǎng)8 h后,菌體濃度均可達(dá)到104-

5、107 CFU/mL;SSSV能有效修復(fù)冷藏和凍藏水產(chǎn)品中冷受傷的目標(biāo)致病菌,人工污染102CFU/mL目標(biāo)菌的冷藏和冷凍蝦仁、目魚(yú)卷及魚(yú)丸樣品經(jīng)SSSV培養(yǎng)基在37℃分別培養(yǎng)8 h和12h可使菌體濃度達(dá)到105-106 CFU/mL;SSSV對(duì)實(shí)際水產(chǎn)樣品中四種致病菌的增菌效果優(yōu)于營(yíng)養(yǎng)肉湯,但略差于國(guó)標(biāo)中目標(biāo)菌各自選擇性增蔭液。V2、篩選出金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的耐熱核酸酶基因nuc、沙門(mén)氏菌(S

6、almonella spp.)的侵襲蛋白基因invA、志賀氏菌(Shigella spp.)的侵染性質(zhì)?？乖璈基因ipaH和副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)的毒力表達(dá)調(diào)控基因toxR作為目標(biāo)靶基因并設(shè)計(jì)相應(yīng)引物對(duì),建立并優(yōu)化了一種快速檢測(cè)水產(chǎn)品中上述四種常見(jiàn)食源性致病菌的多重:PCR方法。結(jié)果顯示,沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌及副溶血性弧菌的多重PCR擴(kuò)增片段產(chǎn)物大小分別為549 bp、426 bp、3

7、48 bp、243 bp,通過(guò)序列測(cè)序及BLAST比對(duì)證明了擴(kuò)增產(chǎn)物的準(zhǔn)確性;該檢測(cè)方法具有良好的特異性和靈敏度,四種目標(biāo)菌的檢測(cè)限分別為志賀氏菌和金黃色葡萄球菌102CFU/mL,沙門(mén)氏菌和副溶血性弧菌為101 CFU/mL。SSSV富集培養(yǎng)與該多重PCR方法聯(lián)用,對(duì)50份實(shí)際水產(chǎn)樣品進(jìn)行檢測(cè),并與國(guó)標(biāo)方法對(duì)比驗(yàn)證得出,四種致病菌的整體檢測(cè)符合率達(dá)97％以上,兩種檢測(cè)方法無(wú)顯著性差異(P＞0.05),但檢測(cè)時(shí)間大幅縮短,可在24 h內(nèi)

8、完成樣品的檢驗(yàn)。
　　 3、實(shí)現(xiàn)了對(duì)上述多重PCR檢測(cè)方法的產(chǎn)品化組裝,開(kāi)發(fā)成適合快速檢測(cè)水產(chǎn)品中沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌的檢測(cè)試劑盒SSSV m-PCR Kit。對(duì)該試劑盒的保存方式,穩(wěn)定性及重復(fù)性進(jìn)行了測(cè)定和評(píng)價(jià)。結(jié)果表明,該實(shí)際盒檢測(cè)效果穩(wěn)定,可重復(fù)性好,4℃保存條件下最長(zhǎng)可30 d-60 d,在-20℃或-80℃條件保存,其保質(zhì)期可接近或達(dá)到一年,但試劑的反復(fù)凍融對(duì)試劑盒的檢測(cè)效果影響較大,使用者