SCA3-MJD患者周血清GFAP-HDAC-HAT-miRNA檢測分析.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分：SCA3/MJD患者外周血清GFAP/HDAC/HAT檢測分析
　　 遺傳性脊髓小腦性共濟失調(diào)(hereditary spinocerebellar ataxia，SCAs)是一類具有明顯臨床和遺傳異質(zhì)性的常見神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，多呈常染色體顯性遺傳，少數(shù)為散發(fā)病例。主要臨床表現(xiàn)為共濟失調(diào)和辨距不良。目前已有30余種SCA亞型，其中脊髓小腦性共濟失調(diào)3型/馬查多約瑟夫?。╯pinoce

2、rebellar ataxia type3/Machado-Joseph disease，SCA3/MJD）是最常見的亞型，在中國漢族人群中約占常染色體顯性遺傳性脊髓小腦性共濟失調(diào)的50％。SCA3/MJD的致病基因為MJD1，其3’端編碼區(qū)含有一段CAG三核苷酸重復(fù)序列。正常人CAG重復(fù)次數(shù)約為12-40次，而SCA3/MJD患者可達51-86次，且CAG異常重復(fù)次數(shù)越多，發(fā)病年齡即越早，癥狀也越嚴重。MJD1的編碼蛋白ataxin-

3、3的羧基端含一段多聚谷氨酰胺（polyglutamine，polyQ）肽鏈，含異常擴展突變型polyQ蛋白的ataxin-3蛋白可選擇性在神經(jīng)系統(tǒng)特定部位（小腦、腦干、脊髓等）聚積形成神經(jīng)元核內(nèi)包涵體（neuronal intranuclear inclusions，NIIs）從而引起神經(jīng)元死亡。目前為止，已發(fā)現(xiàn)九種polyQ異常擴展突變型蛋白聚積引起的遺傳性神經(jīng)退行性疾病，亦稱為polyQ病，包括SCA1、SCA2、SCA3/MJD、

4、SCA6、SCA7、SCA17，以及亨廷頓舞蹈病(huntington disease，HD)、脊髓延髓肌萎縮癥(spinal and bulbarmuscular atrophy，SBMA)、齒狀核紅核蒼白球路易體萎縮癥(dentatorubral-pallidoluysian atrophy, DRPLA).
　　 目前研究已明確異常擴展polyQ突變蛋白的細胞毒性觸發(fā)了這類疾病的發(fā)生，但它們引起神經(jīng)元損害的確切機制仍不清楚

5、。近年研究發(fā)現(xiàn)polyQ疾病中存在轉(zhuǎn)錄異常，多種異常擴展polyQ突變蛋白具有轉(zhuǎn)錄抑制作用，提示轉(zhuǎn)錄抑制機制可能是polyQ疾病共同的發(fā)生機制之一。
　　 組蛋白乙酰化是一種表觀遺傳水平的修飾，能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重塑和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的改變。目前認為當(dāng)組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histoneacetyltransferase，HAT)和組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)活性正常時，組蛋白乙?；?組蛋白去乙

6、酰化水平保持著動態(tài)平衡，從而維持基因正常的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。越來越多研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)退行性疾病中乙?；瘍?nèi)穩(wěn)態(tài)較大程度受損，低乙?；斑^度乙?；蓪?dǎo)致神經(jīng)元死亡。本研究主要探討乙?；Х€(wěn)態(tài)在SCA3/MJD中的作用機制及SCA3/MJD患者血清中乙?；?。
　　 膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glia fibfHary acidic protein，GFAP)是星形膠質(zhì)細胞的標(biāo)志性蛋白。它參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘的形成和維持血腦屏障的完整性。神經(jīng)系

7、統(tǒng)損傷（如神經(jīng)退行性疾病等）時GFAP陽性星形膠質(zhì)細胞則快速表達GFAP，調(diào)節(jié)損傷局部微環(huán)境，協(xié)助于神經(jīng)損傷修復(fù)過程。已證實GFAP可以通過血腦屏障。因此，可通過檢測血清GFAP表達水平了解GFAP陽性星形膠質(zhì)細胞對神經(jīng)退行性疾病等損傷的反應(yīng)程度。
　　 目前，在國內(nèi)外尚未有HDAC、HAT、GFAP在SCA3/MJD人群外周血清中表達水平的相關(guān)報道。
　　 目的：對中國大陸人群臨床診斷為遺傳性脊髓小腦性共濟失調(diào)(SCA

8、)的患者進行MJD1基因檢測分析；了解SCA3/MJD患者外周血清HDAC、HAT、GFAP濃度值及其意義。
　　 方法：①運用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，8％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及T載體克隆測序?qū)Πl(fā)病年齡在18-50歲之間的SCA患者進行MJDI基因檢測，同時行SARA及ICARS評分，選取lOO例SCA3/MJD患者及100例健康對照者，采集分離其空腹外周血清，-80℃凍存?zhèn)溆谩＂谕ㄟ^酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)比較SCA3

9、/MJD與健康對照組血清中HDAC、HAT、GFAP濃度差異。③采用SPSS16.0軟件進行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析。血清GFAP，HDAC及HAT濃度用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。本研究中血清GFAP，HDAC and HAT濃度值不符合正態(tài)分布，采用Wilcoxon rank檢驗進行數(shù)據(jù)處理。組間差異采用方差分析。采用Spearman法分析SCA3/MJD患者血清GFAP及HAT濃度值分別與其CAG重復(fù)次數(shù)、年齡、ICARS評分及SARA評分值的相

10、關(guān)性。
　　 結(jié)果：①研究對象中100例經(jīng)基因檢測確診為SCA3/MJD患者的CAG重復(fù)次數(shù)在61-85次之間；②SCA3/MJD組血清GFAP含量[(8.864±4.328)x102ng/ml]較對照組[(3.929±2.380) X102ng/ml]明顯升高Z=99,12, P<0.05)；③SCA3/MJD組血清HDAC含量[(1.636±1.039)x103 ng/ml]較對照組[(1.594±0.768) x103ng

11、k/ml]無明顯差異(Z=0.11，P>0.05)；④SCA3/MJD組血清HAT含量[(3.563±1.899)x102ng/ml]較對照組[(2.738±1.737) x102ng/ml]明顯升高(Z=10.12，P<0.05)；⑤SCA3/MJD患者外周血清中GFAP和HAT濃度值分別與患者年齡大小、CAG重復(fù)次數(shù)、SARA及ICARS評分值無相關(guān)性(P>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1．SCA3/MJD患者體

12、內(nèi)乙酰化水平升高，提示過度乙?；赡軈⑴cSCA3/MJD的發(fā)病機制；
　　 2. SCA3/MJD患者存在神經(jīng)系統(tǒng)持續(xù)性損傷，GFAP可作為評價SCA3/MJD患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷程度的非特異性標(biāo)志物。
　　 第二部分、SCA3/MJD患者外周血清miRNA檢測分析
　　 MicroRNAs(miRNAs)是一類內(nèi)源性的、大小約21-23個堿基的單鏈非編碼小分子RNA。作為一種新的非蛋白質(zhì)的基因表達調(diào)控因子，近年

13、來國外學(xué)者開始關(guān)注它在神經(jīng)退行性疾病特別是polyQ疾病基因表達調(diào)控中的重要作用。MiRNA作為基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控方式，具有正負向兩種基因調(diào)控方式，在多種細胞和發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有多種特異性表達的miRNA，其對神經(jīng)組織的分化、存活、神經(jīng)可塑性和學(xué)習(xí)與記憶過程均產(chǎn)生作用。特異性的神經(jīng)元中發(fā)生miRNA缺失，將導(dǎo)致這些神經(jīng)元進行性丟失和神經(jīng)退行性疾病病理表型的行為功能缺陷。
　　 脊髓小腦性共濟失調(diào)(spino

14、cerebellar ataxia SCA)是危及人類神經(jīng)系統(tǒng)的較常見的遺傳性神經(jīng)退行性疾病之一。其中脊髓小腦性共濟失調(diào)3型(SCA3/MJD)最為常見。Ataxin-3是SCA3/MJD致病基因MJD1編碼的含有多聚谷氨酰胺(polyglutamine，polyQ)的胞漿蛋白。含異常擴展突變型polyQ蛋白的ataxin-3進入核內(nèi)積聚形成核內(nèi)包涵體，進而導(dǎo)致神經(jīng)細胞死亡。Dicer是miRNA形成和成熟過程中的關(guān)鍵酶。Bilen等研

15、究發(fā)現(xiàn)，敲除HeLa細胞中的Dicer基因后，MJD1基因誘導(dǎo)的細胞毒性作用顯著增強，補給含有HeLa細胞所有miRNA的小分子RNA片段后，細胞毒性會有所降低。因而認為miRNA可能對SCA3/MJD具有神經(jīng)保護作用，但是發(fā)揮具體神經(jīng)保護作用的miRNA亞型以及這種亞型在SCA3/MJD發(fā)病過程中的具體作用途徑尚不清楚。
　　 脊髓小腦性共濟失調(diào)1型(SCA1)在SCA各亞型也較常見。Scheaefer等在對SCAI小鼠模型的

16、研究中發(fā)現(xiàn)，通過小腦蒲肯野細胞特異性的Pcp2啟動子驅(qū)動Cre重組酶將Dicer基因切除后，8周齡小鼠小腦Purkinje細胞的存活及其生理功能的發(fā)揮并不受影響；而13周齡小鼠小腦中Dicer基因敲除后，其Purkinje細胞將發(fā)生進行性變性甚至死亡，同時小鼠出現(xiàn)震顫和共濟失調(diào)表現(xiàn)。由此認為miRNA可能對SCA1具有神經(jīng)保護作用，但其作用靶點和具體作用途徑目前尚未知。
　　 近年各項研究相繼證實外周血清存在穩(wěn)定且特異性表達的m

17、iRNA。此外還存在于尿液、唾液、腦脊液、羊水等人體液中，可動態(tài)反映機體生理及病理狀態(tài)的特點。目前，國內(nèi)外尚未有miRNA在SCA3/MJD患者外周血清中表達譜研究的相關(guān)報道。
　　 目的：檢測SCA3/MJD與健康對照組外周血清中微小RNA(miRNA)的表達差異情況，試圖將SCA3/MJD患者血清中特異性表達的miRNA作作進一步探究，探討這些目標(biāo)miRNA是否為參與SCA3/MJD發(fā)病機制的分子標(biāo)志物。
　　 方法

18、：①應(yīng)用TRIzoI法提取研究對象血清中含miRNA的總RNA;②應(yīng)用microRCURY LNATM Array對9例SCA3/MJD患者和7例健康對照組的血清進行miRNA表達譜檢測；③通過real-timeRT-PCR對35例SCA3/MJD患者及25例健康對照者進行目標(biāo)miRNA的定量分析驗證。
　　 結(jié)果：微陣列結(jié)果篩選出表達顯著下調(diào)的miRNA共26個，表達顯著上調(diào)的miRNA共20個。結(jié)合miRNA數(shù)據(jù)庫預(yù)測分析，

19、選取4個微陣列芯片篩選出的miRNAs(表達下調(diào)者為miR-29a、miR-125b、miR-25;表達上調(diào)者為miR-34b)以及數(shù)據(jù)庫中預(yù)測與SCA3/MJD相關(guān)性較大的2個miRNA(miR-18lb與miR-32*)同時進行real-time RT-PCR定量檢測分析。上述6個miRNA均進一步得到real-time RT-PCR的證實。
　　 結(jié)論：1、miR-18lb、miR-29a、miR-125b、miR-25、

20、miR-32*及miR-34b等6個miRNA在SCA3/MJD患者血清中明顯表達異常，可能參與SCA3/MJD的發(fā)病機制，其中miR-18lb、m1R-29a、miR-125b、miR-25表達下調(diào)，而miR-32*及miR-34b表達上調(diào)；2、miR-18lb、miR.29a、miR-125b、miR-25、miR-32*及miR-34b等6個miRNA可能作為深入探討脊髓小腦型共濟失調(diào)3型(SCA3/MJD)發(fā)病機制的分子標(biāo)志物。