自吞噬途徑在polyQ擴(kuò)展突變型ataxin-3降解及SCA3-MJD發(fā)病機(jī)制中的作用Ataxin-3多克隆抗體的制備.pdf

1、背景：
　　 遺傳性脊髓小腦型共濟(jì)失調(diào)(spinocerebellar ataxia，SCAs)是一組以神經(jīng)細(xì)胞變性為病理特征的神經(jīng)系統(tǒng)遺傳疾病，目前認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制與致病基因外顯子中CAG拷貝數(shù)異常擴(kuò)增產(chǎn)生帶有多聚谷氨酰胺(polyQ)鏈的蛋白有關(guān)。脊髓小腦型共濟(jì)失調(diào)三型/馬查多-約瑟夫病(spinocerebellar ataxia3/Machado-Joseph disease，SCA3/MJD)是SCAs中發(fā)病率較高的亞型

2、，其發(fā)病是由于致病基因MJD1編碼區(qū)內(nèi)3’端的CAG重復(fù)序列異常擴(kuò)增導(dǎo)致其編碼產(chǎn)物ataxin-3蛋白的羧基端多聚谷氨酰胺(polyglutamine，polyQ)肽鏈異常擴(kuò)展引起。Ataxin-3蛋白的生理功能目前還不明確，其羧基端polyQ肽鏈異常擴(kuò)展導(dǎo)致疾病發(fā)生的具體機(jī)制還不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，致病蛋白的降解在此類疾病的發(fā)病機(jī)制中具有重要的意義。
　　 細(xì)胞內(nèi)蛋白主要通過泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin—proteaso

3、mepathway，UPP)和自吞噬途徑(Autophagy)進(jìn)行降解。其中自吞噬途徑在降解清除細(xì)胞自身大分子蛋白復(fù)合物和衰老細(xì)胞器，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的過程中起著非常重要的作用，同時(shí)也是細(xì)胞適應(yīng)外界環(huán)境變化的一種重要機(jī)制。目前研究提示，自吞噬途徑參與降解阿爾茨海默病、多聚谷氨酸疾病(SCA1、Huntingtin病)、帕金森病等多種神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病相關(guān)的致病蛋白并參與其生理及發(fā)病過程。
　　 參與調(diào)節(jié)自吞噬途徑的信號分子種類繁

4、多，其具體調(diào)節(jié)機(jī)制仍不清楚。現(xiàn)在已經(jīng)證實(shí)的是mTOR(mammalian target of rapamycin)對于自吞噬信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的負(fù)性調(diào)節(jié)作用。近年來在對mTOR信號通路眾多上游調(diào)節(jié)蛋白的研究中，LKB1-AMPK途徑受到了廣泛關(guān)注。目前認(rèn)為LKB1是AMPK(AMP-activated protein kinase)重要的蛋白激酶，它能通過磷酸化AMPK第172位蘇氨酸(Thr172)使之活化進(jìn)而參與調(diào)節(jié)mTOR。亦有報(bào)道顯示

5、，LXB1-AMPK途徑能通過介導(dǎo)細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制物p27kip1的磷酸化而直接參與調(diào)節(jié)自吞噬途徑。
　　 在前期研究中，我們構(gòu)建了野生型ataxin-3蛋白和polyQ異常擴(kuò)展突變型ataxin-3蛋白的真核表達(dá)載體：pCDNA3.1-Myc-His(-)B-ataxin-3—20Q和pCDNA3.1-Myc-His(-)B-ataxin-3-68Q。
　　 目的：
　　 擬開展自吞噬途徑對于poly

6、Q擴(kuò)展突變型ataxin-3蛋白的降解、胞內(nèi)聚合物形成、細(xì)胞活性影響的研究，以期較全面的探討其在SCA3/MJD發(fā)病機(jī)制中的作用；進(jìn)一步研究自吞噬途徑可能的上游激酶LKB1能否通過自吞噬途徑參與調(diào)節(jié)polyQ擴(kuò)展突變型ataxin-3蛋白的降解。
　　 方法：
　　 1、應(yīng)用免疫熒光-激光共聚焦技術(shù)、Western印跡技術(shù)明確自吞噬途徑是否參與polyQ擴(kuò)展突變型ataxin-3蛋白的降解；
　　 2、應(yīng)用Wes

7、tern印跡技術(shù)研究LXB1是否參與polyQ擴(kuò)展突變型ataxin-3蛋白的降解；
　　 3、應(yīng)用免疫熒光-激光共聚焦技術(shù)、MTT法探討自吞噬途徑對polyQ擴(kuò)展突變型ataxin-3蛋白細(xì)胞毒性的調(diào)節(jié)作用；
　　 4、應(yīng)用重組基因技術(shù)、Western-blot技術(shù)構(gòu)建并檢測野生型ataxin-3的pGEX-4T-2原核表達(dá)載體并誘導(dǎo)其表達(dá)；
　　 5、應(yīng)用親和層析技術(shù)純化融合蛋白，免疫新西蘭兔制備了高效價(jià)的a

8、taxin-3多克隆抗體；
　　 結(jié)果：
　　 1、免疫熒光-激光共聚焦結(jié)果顯示：共轉(zhuǎn)pCDNA3.1-Myc-His(B)-ataxin-3—68Q和pEGFP-Cl-LC3細(xì)胞組中可見過表達(dá)的LC3與突變ataxin-3形成的胞內(nèi)蛋白聚合體明顯重疊。Western-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：分別經(jīng)3-MA、NH4CL處理的細(xì)胞，ataxin-3-68Q條帶明顯增粗加深，而轉(zhuǎn)染后9小時(shí)加入rapamycin處理細(xì)胞后則at

9、axin-3—68Q條帶變淺，這說明polyQ擴(kuò)展突變型ataxin-3能夠被自吞噬小體識別并包被，自吞噬途徑參與ataxin-3-68Q的降解，抑制或早期促進(jìn)自吞噬途徑能有效減少或增加突變蛋白的降解。
　　 2、Western—blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)LKB1的表達(dá)能抑制轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)polyQ異常擴(kuò)展突變型ataxin-3的降解。
　　 3、免疫熒光結(jié)果顯示：3-MA處理組表達(dá)ataxin-3-68Q的細(xì)胞內(nèi)可見大量的胞內(nèi)蛋白聚

10、合物的形成，從形態(tài)學(xué)上分析，聚合物不僅數(shù)量增多而且形態(tài)更大，大部分聚集在胞核周圍；轉(zhuǎn)染后9小時(shí)加入rapamycin處理組細(xì)胞中，ataxin-3-68Q形成的胞內(nèi)聚合物則明顯減少。進(jìn)一步說明抑制自吞噬途徑能增加細(xì)胞內(nèi)ataxin-3-68Q蛋白聚合體的形成，反之亦然。經(jīng)rapamycin處理的兩組細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后早期(9小時(shí))處理組較對照組中ataxin-3-68Q表達(dá)減少，但轉(zhuǎn)染后晚期(16小時(shí))處理組目標(biāo)蛋白表達(dá)變化不大。這說明在突

11、變蛋白表達(dá)早期激活胞內(nèi)自噬水平能加快聚合物的降解清除。
　　 4、MTT分析結(jié)果顯示，與ataxin-3-68Q對照組比較：3-MA組組聚合體陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加，細(xì)胞活性降低(P<0.05)；轉(zhuǎn)染后9小時(shí)加入rapamycin組聚合體陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，細(xì)胞活性有所增加(P<0.005)；轉(zhuǎn)染后16小時(shí)加入rapamycin組，聚合體陽性細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，細(xì)胞活性反而降低(P<0.01)。
　　 5

12、、DNA測序證實(shí)所構(gòu)建的野生型ataxin-3氨基端的原核表達(dá)載體的目的基因位點(diǎn)均與ataxin-3在GenBank中的標(biāo)準(zhǔn)序列(S75313)完全匹配。核對各載體的閱讀框在插入目的基因序列后均無移碼，說明原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。
　　 6、Western-blot、免疫熒光結(jié)果均證實(shí)制備的多克隆抗體能夠識別ataxin-3蛋白，具有較高特異性。
　　 結(jié)論：
　　 1證實(shí)自吞噬途徑參與細(xì)胞內(nèi)polyQ異常擴(kuò)展突變

13、型ataxin-3蛋白的降解；
　　 2發(fā)現(xiàn)抑制或早期刺激自吞噬途徑能分別抑制或促進(jìn)胞內(nèi)polyQ擴(kuò)展突變型ataxin-3蛋白的降解；
　　 3首次發(fā)現(xiàn)LKB1的表達(dá)抑制polyQ擴(kuò)展突變型ataxin-3蛋白的降解；
　　 4證實(shí)自吞噬途徑能促進(jìn)polyQ擴(kuò)展突變型ataxin-3蛋白的降解，減少胞內(nèi)聚合體的形成，減輕細(xì)胞毒性；
　　 5制備了ataxin-3-N蛋白特異性抗體，可用于進(jìn)一步研究其相關(guān)