2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、脊髓小腦型共濟(jì)失調(diào)(spinocerebellar ataxia,SCAs)是一類具有高度臨床和遺傳異質(zhì)性的遺傳性神經(jīng)退行性疾病。患病率約為5-10/10萬,占神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病的10%-15%。多呈常染色體顯性遺傳,散發(fā)性病例亦不少見。隨著分子遺傳學(xué)技術(shù)方法的不斷更新和應(yīng)用,迄今已定位31個(gè)致病基因位點(diǎn),克隆21個(gè)致病基因,其中以脊髓小腦型共濟(jì)失調(diào)3型/馬查多約瑟夫病(spinocerebellar ataxia type3/Machad

2、o-Joseph disease,SCA3/MJD)最為常見,約占中國(guó)漢族人群中常染色體顯性遺傳脊髓小腦型共濟(jì)失調(diào)的62.09%。SCA3/MJD致病基因—ATXN3編碼區(qū)的羧基端含有一段CAG三核苷酸重復(fù)序列,正常人的重復(fù)拷貝數(shù)在12-40次之間,而患者的重復(fù)拷貝數(shù)可達(dá)51-86次。該病有明顯的遺傳早先現(xiàn)象(aniticipation),其重復(fù)拷貝數(shù)與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān),CAG異常重復(fù)拷貝數(shù)越多,疾病發(fā)病年齡越早,臨床表現(xiàn)也越嚴(yán)重。

3、
  本病的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。目前認(rèn)為,本病的發(fā)生主要與“毒性功能的獲得(gain of toxic function)”機(jī)制有關(guān),即:致病基因ATXN3編碼蛋白內(nèi)由于形成異常擴(kuò)展的多聚谷氨酰胺(polyglutamine,polyQ)肽鏈,容易錯(cuò)誤折疊,并選擇性的在特定的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(小腦、腦干、脊髓等)細(xì)胞內(nèi)積聚形成神經(jīng)元核內(nèi)包涵體(neuronalintranuclear inclusions,NIIs)而產(chǎn)生細(xì)胞毒性作

4、用(cytotoxicity),最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。盡管這些polyQ突變蛋白引起神經(jīng)元損害的確切
  機(jī)制還不十分清楚,但大量研究已證實(shí)他們是促成疾病發(fā)生發(fā)展的始動(dòng)因素,深入研究致病基因ATXN3及其編碼蛋白ataxin-3的表達(dá)調(diào)控機(jī)制有助于了解SCA3的分子遺傳學(xué)機(jī)制,為尋求有效的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。
  微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一類新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性非編碼小RNA分子,廣泛存在于真核生物中,主要

5、由含發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個(gè)堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成。其作用機(jī)制主要是通過與靶基因信使RNA(manage RNA,mRNA)的3'端非翻譯區(qū)(3'untranslation region,3'UTR)種子序列(seed sequence)特異性堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合,從而在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平影響靶基因的表達(dá)。近年來,隨著對(duì)miRNAs研究的不斷深入,國(guó)外學(xué)者日益關(guān)注miRNAs在神經(jīng)退行性疾病特別是在polyQ病基因

6、表達(dá)調(diào)控中的重要作用。
  Bilen等在SCA3/MJD細(xì)胞模型中發(fā)現(xiàn),RNA干擾介導(dǎo)的Dicer基因沉默能明顯增強(qiáng)poly擴(kuò)展突變型ataxin-3蛋白所致的細(xì)胞毒性作用,而補(bǔ)給含有細(xì)胞所有miRNAs的小RNA片段后,細(xì)胞毒性有所減弱。這些信息提示miRNAs可能對(duì)SCA3/MJD具有神經(jīng)保護(hù)作用,它們通過在體內(nèi)一定水平的表達(dá),直接或間接抑制致病蛋白ataxin-3的神經(jīng)毒性,從而減緩SCA3/MJD的病情。
  近年

7、來,越來越多的研究證實(shí)miRNAs能直接或間接靶向調(diào)控SCA1、DRPLA、HD等多種polyQ病致病基因的表達(dá),減輕其神經(jīng)毒性作用,延緩病情進(jìn)展。那么對(duì)于polyQ病中最常見的SCA3/MJD而言,是否存在相似的調(diào)節(jié)機(jī)制?具體調(diào)控致病基因ATXN3的miRNA亞型是什么?迄今國(guó)內(nèi)外尚無相關(guān)報(bào)道。在前期研究中,本課題組成員已應(yīng)用miRNAs芯片技術(shù)篩選獲得SCA3/MJD患者與健康對(duì)照組外周血清中miRNAs的差異表達(dá)譜,并應(yīng)用生物信息

8、學(xué)方法及實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)其結(jié)果進(jìn)行初步驗(yàn)證,獲得可能與致病基因ATX的靶向作用4種miRNAs—miR-29a、miR-125b、miR-25及miR-34b。
  目的:
  在前期研究基礎(chǔ)上,進(jìn)一步了解異常表達(dá)miRNAs與ATXN3基因mRNA3'UTR的相互作用,探討異常表達(dá)miRNAs參與調(diào)節(jié)SCA3/MJD發(fā)病的可能分子機(jī)制,為進(jìn)一步闡明SCA3/MJD等polyQ病的分子發(fā)病機(jī)制,尋求新的治療靶點(diǎn)提供理

9、論依據(jù)。
  方法:
  1.應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測(cè)異常表達(dá)的miRNAs對(duì)內(nèi)源性野生型ataxin-3蛋白表達(dá)水平的影響;
  2.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)所發(fā)現(xiàn)miRNA亞型對(duì)內(nèi)源性野生型ATXN3基因mRNA表達(dá)水平的影響。
  3.應(yīng)用酶切連接法構(gòu)建pmirGLO-ATXN33'UTR熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體,應(yīng)用PCR突變法構(gòu)建pmirGLO-ATXN33'UTR熒光素酶報(bào)告基因突變

10、體;
  4.應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)異常表達(dá)的miR-25對(duì)pmirGLO-ATXN33'UTR載體及突變體螢火蟲熒光素酶相對(duì)活性的影響;
  結(jié)果:
  1.Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn):予以miR-29a模擬物(mimics)、miR-34bmimics及miR-125b mimics分別上調(diào)各相應(yīng)miRNAs亞型表達(dá)水平后,HEK293T細(xì)胞系中的內(nèi)源性野生型ataxin-3蛋白表達(dá)水平較neg

11、ative mimics干預(yù)組無明顯差異;而miR-25 mimics上調(diào)miR-25表達(dá)水平后,內(nèi)源性野生型ataxin-3蛋白表達(dá)水平顯著低于negative mimics干預(yù)組,其結(jié)果較siATXN3干預(yù)組無明顯差異;
  2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示:予miR-25 mimics上調(diào)miR-25表達(dá)水平后,HEK293T細(xì)胞系中內(nèi)源性ATXN3基因mRNA表達(dá)水平較negative mimics干預(yù)組無明顯差異;予miR

12、-25inhibitor下調(diào)miR-25表達(dá)水平后,HEK293細(xì)胞系中內(nèi)源性ATXN3基因mRNA表達(dá)水平較negative mimics干預(yù)組無明顯差異;
  3.應(yīng)用酶切連接法成功構(gòu)建pmirGLO-ATXN33'UTR熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體,測(cè)序結(jié)果顯示插入的ATXN33'UTR部分序列與NCBI人類基因組庫(kù)公布的NM_004993序列1-1531bp信息完全一致;應(yīng)用PCR突變法成功將miR-25與ATXN3基因mRN

13、A3'UTR預(yù)測(cè)結(jié)合靶序列突變并構(gòu)建pmirGLO-ATXN33'UTR熒光素酶報(bào)告基因突變體,測(cè)序結(jié)果顯示成功將靶序列GTGCAAT突變?yōu)镃TCGATA;
  4.雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示:予miR-25 mimics上調(diào)miR-25表達(dá)水平后,pmirGLO-ATXN33'UTR熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞螢火蟲熒光素酶相對(duì)活性水平顯著低于negative mimics干預(yù)組,而pmirGLO-ATXN33'UTR

14、熒光素酶報(bào)告基因突變體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞螢火蟲熒光素酶相對(duì)活性水平較negative mimics干預(yù)組無明顯差別。
  結(jié)論:
  1.首次發(fā)現(xiàn)miR-25能降低內(nèi)源性ataxin-3蛋白表達(dá)水平,不能下調(diào)內(nèi)源性ATXN3基因mRNA表達(dá)水平,推測(cè)miR-25是可能是通過翻譯抑制途徑來發(fā)揮調(diào)控作用,對(duì)SCA3/MJD疾病具有潛在神經(jīng)保護(hù)價(jià)值。
  2.發(fā)現(xiàn)miR-25能直接對(duì)ATXN3基因進(jìn)行靶向調(diào)控,明確其作用靶點(diǎn)是ATX

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