水稻胞質(zhì)6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶基因的功能分析.pdf

1、磷酸戊糖途徑(Pentose phosphate pathway,PPP)與植物的生長(zhǎng)發(fā)育及多種脅迫應(yīng)答相關(guān),6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6-phosphogluconate dehydrogenase,6PGDH,EC1.1.1.44)和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(Glucose-6-phophate dehydrogenase,G6PDHEC1.1.1.49)是PPP途徑的兩個(gè)關(guān)鍵酶。植物細(xì)胞中的6PGDH與G6PDH均可分成胞質(zhì)與質(zhì)體兩種

2、類型。6PGDH酶催化PPP途徑的第三步反應(yīng),將6-磷酸葡萄糖酸脫氫后生成5磷酸核酮糖CO2,同時(shí)伴隨NADP+的還原,此反應(yīng)是不可逆的。本實(shí)驗(yàn)室研究表明,水稻胞質(zhì)6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶基因Os6PGDH1在水稻幼苗中的表達(dá)受高鹽、低溫、干旱和ABA等不同程度誘導(dǎo),在非生物脅迫下水稻幼苗中6PGDH的酶活性顯著增強(qiáng),Os6PGDH1可能參與并調(diào)節(jié)水稻對(duì)非生物脅迫的應(yīng)答。 為了研究Os6PGDH1基因的功能,以已公布的Os6PGD

3、H1(GenBank 注冊(cè)號(hào)：AF486280)cDNA序列為探針,利用BLAST軟件搜索水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù),設(shè)計(jì)引物,經(jīng)RT-PCR克隆獲得了Os6PGDH1基因的完整ORF。構(gòu)建原核表達(dá)載體pET30(+)-Os6PGDH1,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21細(xì)胞,通過IPTG誘導(dǎo)外源基因表達(dá),并測(cè)定了重組細(xì)菌總蛋白的相對(duì)酶活性,證明編碼融合蛋白的重組質(zhì)粒(pET30a(+)-Os6PGDH1)細(xì)菌在經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,細(xì)菌總蛋白的相對(duì)酶活性比

4、含有空載體pET30a(+)細(xì)菌的相對(duì)酶活性高40.06％,初步證明Os6PGDH1基因是一個(gè)編碼6PGDH的功能基因。構(gòu)建了瞬時(shí)表達(dá)載體pBI121-Os6PGDH1-GUS,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞,結(jié)果表明Os6PGDH1定位于洋蔥表皮細(xì)胞的胞質(zhì)中。構(gòu)建植物表達(dá)載體pBI121-Os6PGDH1,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)葉盤轉(zhuǎn)化法將Os6PGDH1轉(zhuǎn)化到野生型煙草,經(jīng)卡那霉素抗性篩選、PCR和RT-PCR檢測(cè),獲得了轉(zhuǎn)Os6PGDH