三水白虎湯對滑膜成纖維細胞增殖和一氧化氮生成的抑制作用.pdf

1、一．研究背景 滑膜炎(synovitis)是多種疾病(如創(chuàng)傷、風濕類疾病、關節(jié)退變、結核、色素沉著絨毛結節(jié)等)在滑膜組織方面的特定的滑膜炎癥反應和共同表現(xiàn)。膝關節(jié)是人體滑膜最多，關節(jié)面最大和結構最復雜的關節(jié)，臨床上滑膜炎多表現(xiàn)在膝關節(jié)滑膜炎，現(xiàn)有滑膜組織細胞的研究資料大都來自人和動物的關節(jié)(主要是膝關節(jié))。在類風濕關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)的發(fā)生發(fā)展中，滑膜炎進一步發(fā)展轉為慢性，滑膜細胞及滑膜下結締

2、組織纖維異常增生并侵蝕周圍軟骨和關節(jié)，形成難治性的類風濕關節(jié)炎，如能找到確實可靠的方法來啟動其內部調控機制，影響或改變成纖維細胞向滑膜成纖維細胞分化，有效抑制滑膜細胞的異常增生，將會對臨床治療滑膜疾病(代表病種有類風濕關節(jié)炎等)，揭示其病理機制產生重要影響。 類風濕關節(jié)炎(RA)是一種以關節(jié)滑膜炎癥為病理中心的自身免疫性疾病。滑膜增生并形成血管翳是軟骨和骨質破壞的關鍵因素。研究顯示類風濕關節(jié)炎的發(fā)生機制中與成纖維細胞向滑膜成纖維

3、細胞分化關系密切，滑膜成纖維細胞的異常增生導致滑膜炎并惡性進展造成關節(jié)和軟骨破壞，而骨關節(jié)炎(Osteo-aIthritic，OA)發(fā)展到嚴重階段，滑膜增生也是一個重要的病理環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)醫(yī)學上類風濕關節(jié)炎(RA)屬于中醫(yī)痹證，歷節(jié)的范疇，目前RA發(fā)病原因及機制尚未完全明確。臨床上尚缺乏根治方法和預防措施，傳統(tǒng)的治療主要針對炎癥及后遺癥。因此，尋求從最有效控制滑膜增生和軟骨侵蝕的途徑治療RA是近幾年來策略的重點。當前國內外治療RA的常用藥物

4、有非甾體抗炎藥(NSAIDS，如布洛芬)、改善病情的抗風濕藥物(DMARDS，又叫慢作用藥，如甲氨喋呤MTX、來氟米特等)、糖皮質激素、植物藥、生物制劑以及基因療法，其中來氟米特(1eflurloreide，LEF)能明顯延緩病情進展，被肯定為病情改善藥。 中醫(yī)藥治療RA不僅有良好的抗炎鎮(zhèn)痛效果，而且對患者的生存質量有明顯的改善，其毒副作用較少，并且能調節(jié)機體免疫功能，影響關節(jié)滑膜超微結構以及細胞功能。臨床上發(fā)現(xiàn)很多治療RA的有

5、效方劑和單味藥，我們根據長期臨床經驗自擬的三水白虎湯(ShanshlJibaihu Decoction，SSBHD)，具有顯著改善RA病情的作用。 RA病程活動期及慢性急性發(fā)作期其臨床表現(xiàn)多數(shù)為關節(jié)紅腫疼痛，痛不可觸，或伴發(fā)熱口渴，苔黃燥，脈滑數(shù)等，此為熱痹證候主要依據。三水白虎湯是在經方白虎湯的基礎上加減化裁而成，專為熱痹(主要包括RA的熱痹型)而設。其主藥為水牛角、寒水石、白芥子、虎杖、雞血藤等，其主要功效在于清熱除濕、活血

6、通絡止痛。 我們的研究發(fā)現(xiàn)，三水白虎湯可以有效地幫助控制局部炎癥，消除局部腫脹，緩解疼痛。同時有助于降低實驗指標如CCP、IgG-RF表明三水白虎湯對RA免疫活動產生調節(jié)作用。動物實驗研究中我們以三水白虎湯和LEF分組單獨治療急性發(fā)病期的CIA模型大鼠，實驗表明，三水白虎湯和LEF均能明顯減輕大鼠后肢關節(jié)紅熱、腫脹和疼痛。從而進一步在動物實驗上驗證三水白虎湯治療熱痹的功效，該實驗論文在發(fā)表中。 國內中醫(yī)藥治療和研究痹證的

7、一直備受關注，三水白虎湯治療熱痹的作用機制目前尚不清楚，我們對該復方中藥治療RA的機理進行初步研究，通過應用中藥三水白虎湯含藥血清體外培養(yǎng)滑膜成纖維細胞觀察其增殖抑制和對表達一氧化氮的影響。復方中藥體外實驗主要有兩種方法，一種是將中藥粗提物直接添加(如水煎液)作為作用細胞的處理因素，另一種是制成含藥血清作為作用于細胞的處理因素。兩者方法各有優(yōu)缺點而含藥血清法具有兩大優(yōu)勢：一方面是體現(xiàn)復方藥物的體內生化轉化效應；另外一方面克服藥物本身理化

8、性質對實驗的直接干擾。含藥血清對離體系統(tǒng)同樣也有干擾，但與直接加藥法相比，血清藥研究仍有很大的優(yōu)越性，也是近年該領域研究的熱點。二、研究目的和意義上文中述，RA病程中最明顯特征是滑膜襯層里滑膜成纖維細胞的增生。為了進一步明確三水白虎湯治療熱痹(主為RA)的作用機制，我們設計從體外培養(yǎng)膝關節(jié)滑膜炎滑膜細胞觀察復方中藥三水白虎湯含藥血清對滑膜細胞增殖抑制的影響，尋求三水白虎湯是否有效控制滑膜增生這一途徑為其治療RA提供實驗依據，初步探討三水

9、白虎湯治療熱痹的作用機制。 三．方法和內容1．滑膜標本來源滑膜組織取自南方醫(yī)院脊柱外科住院病人膝骨關節(jié)炎患者(女，68歲，住院號274447)行膝關節(jié)鏡手術中切除的滑膜組織，該患者臨床表現(xiàn)符合熱痹證候診斷標準，同時該患者診斷標準符合參照1986年美國風濕病學會推薦的膝OA診斷標準。 2．三水白虎湯、來氟米特及生理鹽水的含藥血清分組、制備和給藥將Wistar雌性大鼠15R大鼠分層隨機分為三水白虎湯組(A組)、來氟米特組(B

10、組)以及生理鹽水組(即空白血清組，C組)，每組5只。水煎三水白虎湯二次，混合兩次煎取液進行濃縮，最終濃度為含生藥1g/ml；把來氟米特片制成粉末溶于生理鹽水中制成含藥濃度0.18g/ml懸液。三組分別連續(xù)灌胃7天后腹主動脈取血，離心取血清處理后-20℃保存?zhèn)溆谩?3．滑膜細胞體外培養(yǎng)：采用組織塊培養(yǎng)法滑膜取自OA患者關節(jié)鏡手術，超凈臺上無菌操作。組織塊接種后，置于37℃，體積分數(shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔1～2天換培養(yǎng)液

11、1次，待有滑膜成纖維細胞長出后，去除組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞長滿后消化，配制成細胞懸液，計數(shù)并進行滑膜B型活性鑒定，一般形態(tài)學觀察后傳代培養(yǎng)?；型細胞鑒定采用免疫組織化學法，按鼠抗人Vimentin單克隆抗體免疫組織化學鏈霉親和素一生物素化過氧化物酶復合物試劑盒(武漢博士德公司)操作進行。4．滑膜細胞增殖抑制實驗：直接計數(shù)法、四甲基偶氮唑鹽(MTT)檢測法觀察滑膜細胞的增殖，析因設計實驗分組。 直接計數(shù)法：取生長良好的3代細

12、胞，制成2×10<'6> ml<'-1>細胞懸液，分四組，分別為三水白虎湯組(A組)、來氟米特組(B組)以及生理鹽水組(即空白血清組，C組)，D組為不加任何含藥血清的完全培養(yǎng)液組(即正常對照組)。 四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測 把生長良好的4代細胞消化配制成以5×10<'6>ml<'-1>液接種于96孔板，每板分A、B、C、D共4組按下列方法加液：分別在每孔加液至分別為10％、20％、30％、40％、50％終濃度的A、

13、B、C三組含藥血清和培養(yǎng)液(正常對照組)，每板設置一個1空白調零孔不加細胞只加培養(yǎng)液，作為以后MTT測定OD值時調零用。 5．培養(yǎng)前后細胞上清中一氧化氮的檢測：一氧化氮化學性質活潑，在體內代謝很快轉化為NO<,2><'->和NO<,3><'->，而NO<,2><'->又進一步轉化為NO<,3><'->，利用硝酸還原酶可以特異性地將NO<,3><'->還原為NO<,2><'->，通過顯色深淺測定其濃度的高低。 四．結果

14、 1．組織塊養(yǎng)72h后開始見細胞從組織快邊緣伸出生長突，第6天后迅速增加，第12天左右長滿瓶底 70％。傳代后生長較快。 2．直接計數(shù)法 C組生理鹽水空白血清組和D組正常對照組兩正常對照組的細胞增殖曲線走勢趨同，C組和D組對滑膜細胞的生長均有顯著增殖效應；當含藥血清濃度增加為10％和20％時，A、B組細胞數(shù)從培養(yǎng)第一天后起減少顯著，A、B組分別和C、D兩組比較細胞數(shù)，差異有顯著意義，<'△>P<0.001。 3．MT

15、T比色法檢測A、B組分別與正常對照組D組比較細胞增殖計數(shù)：<'△><'△>P<0.001；分別與生理鹽水空白血清組D組比較<'□>P<0.001，結果提示A組、B組分別對體外培養(yǎng)關節(jié)炎滑膜細胞增殖均有顯著抑制作用。 4．滑膜細胞在含藥血清作用下，加入不同組別后(終濃度為20％)測定培養(yǎng)上清液中一氧化氮的含量，結果顯示，三水白虎湯組(9.568±2.173μmol/L)和來氟米特含藥血清組(12.919±1.320μmol/L)分

16、別與生理鹽水含藥血清組(677.796±229.118μmol/L)、正常對照組(1242.597±364.949μmol/L)比較，差異均有顯著性意義(P<0.001)。 五．結論 (一)、生理鹽水含藥血清組和正常對照組對體外培養(yǎng)滑膜成纖維細胞增殖曲線走勢趨同，均具顯著增殖效應。 (二)、三水白虎湯含藥血清和來氟米特含藥血清對體外培養(yǎng)滑膜細胞的增殖有顯著抑制效應，該抑制效應分別和生理鹽水空白血清組、正常對照組的增殖促進

17、效應比較，差異有顯著意義。 (三)、三水白虎湯含藥血清組和來氟米特含藥血清組均能顯著減少培養(yǎng)上清液中一氧化氮的含量，與生理鹽水含藥血清組、正常對照組比較差異有顯著意義。 (四)、復方中藥三水白虎湯含藥血清法對體外培養(yǎng)滑膜細胞的增殖有明顯抑制效應，并且抑制增殖的過程中滑膜細胞分泌一氧化氮同時受到顯著抑制。三水白虎湯有效控制滑膜增生這一途徑可能為三水白虎湯治療熱痹(尤為RA)的重要作用機制之一，抑制滑膜成纖維細胞增生過程顯著抑制其分