三水白虎湯對滑膜成纖維細胞增殖和一氧化氮生成的抑制作用.pdf

1、一．研究背景 滑膜炎(synovitis)是多種疾病(如創(chuàng)傷、風(fēng)濕類疾病、關(guān)節(jié)退變、結(jié)核、色素沉著絨毛結(jié)節(jié)等)在滑膜組織方面的特定的滑膜炎癥反應(yīng)和共同表現(xiàn)。膝關(guān)節(jié)是人體滑膜最多，關(guān)節(jié)面最大和結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的關(guān)節(jié)，臨床上滑膜炎多表現(xiàn)在膝關(guān)節(jié)滑膜炎，現(xiàn)有滑膜組織細胞的研究資料大都來自人和動物的關(guān)節(jié)(主要是膝關(guān)節(jié))。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)的發(fā)生發(fā)展中，滑膜炎進一步發(fā)展轉(zhuǎn)為慢性，滑膜細胞及滑膜下結(jié)締

2、組織纖維異常增生并侵蝕周圍軟骨和關(guān)節(jié)，形成難治性的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，如能找到確實可靠的方法來啟動其內(nèi)部調(diào)控機制，影響或改變成纖維細胞向滑膜成纖維細胞分化，有效抑制滑膜細胞的異常增生，將會對臨床治療滑膜疾病(代表病種有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等)，揭示其病理機制產(chǎn)生重要影響。 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為病理中心的自身免疫性疾病。滑膜增生并形成血管翳是軟骨和骨質(zhì)破壞的關(guān)鍵因素。研究顯示類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生機制中與成纖維細胞向滑膜成纖維

3、細胞分化關(guān)系密切，滑膜成纖維細胞的異常增生導(dǎo)致滑膜炎并惡性進展造成關(guān)節(jié)和軟骨破壞，而骨關(guān)節(jié)炎(Osteo-aIthritic，OA)發(fā)展到嚴重階段，滑膜增生也是一個重要的病理環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)上類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)屬于中醫(yī)痹證，歷節(jié)的范疇，目前RA發(fā)病原因及機制尚未完全明確。臨床上尚缺乏根治方法和預(yù)防措施，傳統(tǒng)的治療主要針對炎癥及后遺癥。因此，尋求從最有效控制滑膜增生和軟骨侵蝕的途徑治療RA是近幾年來策略的重點。當(dāng)前國內(nèi)外治療RA的常用藥物

4、有非甾體抗炎藥(NSAIDS，如布洛芬)、改善病情的抗風(fēng)濕藥物(DMARDS，又叫慢作用藥，如甲氨喋呤MTX、來氟米特等)、糖皮質(zhì)激素、植物藥、生物制劑以及基因療法，其中來氟米特(1eflurloreide，LEF)能明顯延緩病情進展，被肯定為病情改善藥。 中醫(yī)藥治療RA不僅有良好的抗炎鎮(zhèn)痛效果，而且對患者的生存質(zhì)量有明顯的改善，其毒副作用較少，并且能調(diào)節(jié)機體免疫功能，影響關(guān)節(jié)滑膜超微結(jié)構(gòu)以及細胞功能。臨床上發(fā)現(xiàn)很多治療RA的有

5、效方劑和單味藥，我們根據(jù)長期臨床經(jīng)驗自擬的三水白虎湯(ShanshlJibaihu Decoction，SSBHD)，具有顯著改善RA病情的作用。 RA病程活動期及慢性急性發(fā)作期其臨床表現(xiàn)多數(shù)為關(guān)節(jié)紅腫疼痛，痛不可觸，或伴發(fā)熱口渴，苔黃燥，脈滑數(shù)等，此為熱痹證候主要依據(jù)。三水白虎湯是在經(jīng)方白虎湯的基礎(chǔ)上加減化裁而成，專為熱痹(主要包括RA的熱痹型)而設(shè)。其主藥為水牛角、寒水石、白芥子、虎杖、雞血藤等，其主要功效在于清熱除濕、活血

6、通絡(luò)止痛。 我們的研究發(fā)現(xiàn)，三水白虎湯可以有效地幫助控制局部炎癥，消除局部腫脹，緩解疼痛。同時有助于降低實驗指標(biāo)如CCP、IgG-RF表明三水白虎湯對RA免疫活動產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。動物實驗研究中我們以三水白虎湯和LEF分組單獨治療急性發(fā)病期的CIA模型大鼠，實驗表明，三水白虎湯和LEF均能明顯減輕大鼠后肢關(guān)節(jié)紅熱、腫脹和疼痛。從而進一步在動物實驗上驗證三水白虎湯治療熱痹的功效，該實驗論文在發(fā)表中。 國內(nèi)中醫(yī)藥治療和研究痹證的

7、一直備受關(guān)注，三水白虎湯治療熱痹的作用機制目前尚不清楚，我們對該復(fù)方中藥治療RA的機理進行初步研究，通過應(yīng)用中藥三水白虎湯含藥血清體外培養(yǎng)滑膜成纖維細胞觀察其增殖抑制和對表達一氧化氮的影響。復(fù)方中藥體外實驗主要有兩種方法，一種是將中藥粗提物直接添加(如水煎液)作為作用細胞的處理因素，另一種是制成含藥血清作為作用于細胞的處理因素。兩者方法各有優(yōu)缺點而含藥血清法具有兩大優(yōu)勢：一方面是體現(xiàn)復(fù)方藥物的體內(nèi)生化轉(zhuǎn)化效應(yīng)；另外一方面克服藥物本身理化

8、性質(zhì)對實驗的直接干擾。含藥血清對離體系統(tǒng)同樣也有干擾，但與直接加藥法相比，血清藥研究仍有很大的優(yōu)越性，也是近年該領(lǐng)域研究的熱點。二、研究目的和意義上文中述，RA病程中最明顯特征是滑膜襯層里滑膜成纖維細胞的增生。為了進一步明確三水白虎湯治療熱痹(主為RA)的作用機制，我們設(shè)計從體外培養(yǎng)膝關(guān)節(jié)滑膜炎滑膜細胞觀察復(fù)方中藥三水白虎湯含藥血清對滑膜細胞增殖抑制的影響，尋求三水白虎湯是否有效控制滑膜增生這一途徑為其治療RA提供實驗依據(jù)，初步探討三水

9、白虎湯治療熱痹的作用機制。 三．方法和內(nèi)容1．滑膜標(biāo)本來源滑膜組織取自南方醫(yī)院脊柱外科住院病人膝骨關(guān)節(jié)炎患者(女，68歲，住院號274447)行膝關(guān)節(jié)鏡手術(shù)中切除的滑膜組織，該患者臨床表現(xiàn)符合熱痹證候診斷標(biāo)準(zhǔn)，同時該患者診斷標(biāo)準(zhǔn)符合參照1986年美國風(fēng)濕病學(xué)會推薦的膝OA診斷標(biāo)準(zhǔn)。 2．三水白虎湯、來氟米特及生理鹽水的含藥血清分組、制備和給藥將Wistar雌性大鼠15R大鼠分層隨機分為三水白虎湯組(A組)、來氟米特組(B

10、組)以及生理鹽水組(即空白血清組，C組)，每組5只。水煎三水白虎湯二次，混合兩次煎取液進行濃縮，最終濃度為含生藥1g/ml；把來氟米特片制成粉末溶于生理鹽水中制成含藥濃度0.18g/ml懸液。三組分別連續(xù)灌胃7天后腹主動脈取血，離心取血清處理后-20℃保存?zhèn)溆谩?3．滑膜細胞體外培養(yǎng)：采用組織塊培養(yǎng)法滑膜取自O(shè)A患者關(guān)節(jié)鏡手術(shù)，超凈臺上無菌操作。組織塊接種后，置于37℃，體積分數(shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔1～2天換培養(yǎng)液

11、1次，待有滑膜成纖維細胞長出后，去除組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞長滿后消化，配制成細胞懸液，計數(shù)并進行滑膜B型活性鑒定，一般形態(tài)學(xué)觀察后傳代培養(yǎng)?；型細胞鑒定采用免疫組織化學(xué)法，按鼠抗人Vimentin單克隆抗體免疫組織化學(xué)鏈霉親和素一生物素化過氧化物酶復(fù)合物試劑盒(武漢博士德公司)操作進行。4．滑膜細胞增殖抑制實驗：直接計數(shù)法、四甲基偶氮唑鹽(MTT)檢測法觀察滑膜細胞的增殖，析因設(shè)計實驗分組。 直接計數(shù)法：取生長良好的3代細

12、胞，制成2×10<'6> ml<'-1>細胞懸液，分四組，分別為三水白虎湯組(A組)、來氟米特組(B組)以及生理鹽水組(即空白血清組，C組)，D組為不加任何含藥血清的完全培養(yǎng)液組(即正常對照組)。 四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測 把生長良好的4代細胞消化配制成以5×10<'6>ml<'-1>液接種于96孔板，每板分A、B、C、D共4組按下列方法加液：分別在每孔加液至分別為10％、20％、30％、40％、50％終濃度的A、

13、B、C三組含藥血清和培養(yǎng)液(正常對照組)，每板設(shè)置一個1空白調(diào)零孔不加細胞只加培養(yǎng)液，作為以后MTT測定OD值時調(diào)零用。 5．培養(yǎng)前后細胞上清中一氧化氮的檢測：一氧化氮化學(xué)性質(zhì)活潑，在體內(nèi)代謝很快轉(zhuǎn)化為NO<,2><'->和NO<,3><'->，而NO<,2><'->又進一步轉(zhuǎn)化為NO<,3><'->，利用硝酸還原酶可以特異性地將NO<,3><'->還原為NO<,2><'->，通過顯色深淺測定其濃度的高低。 四．結(jié)果

14、 1．組織塊養(yǎng)72h后開始見細胞從組織快邊緣伸出生長突，第6天后迅速增加，第12天左右長滿瓶底 70％。傳代后生長較快。 2．直接計數(shù)法 C組生理鹽水空白血清組和D組正常對照組兩正常對照組的細胞增殖曲線走勢趨同，C組和D組對滑膜細胞的生長均有顯著增殖效應(yīng)；當(dāng)含藥血清濃度增加為10％和20％時，A、B組細胞數(shù)從培養(yǎng)第一天后起減少顯著，A、B組分別和C、D兩組比較細胞數(shù)，差異有顯著意義，<'△>P<0.001。 3．MT

15、T比色法檢測A、B組分別與正常對照組D組比較細胞增殖計數(shù)：<'△><'△>P<0.001；分別與生理鹽水空白血清組D組比較<'□>P<0.001，結(jié)果提示A組、B組分別對體外培養(yǎng)關(guān)節(jié)炎滑膜細胞增殖均有顯著抑制作用。 4．滑膜細胞在含藥血清作用下，加入不同組別后(終濃度為20％)測定培養(yǎng)上清液中一氧化氮的含量，結(jié)果顯示，三水白虎湯組(9.568±2.173μmol/L)和來氟米特含藥血清組(12.919±1.320μmol/L)分

16、別與生理鹽水含藥血清組(677.796±229.118μmol/L)、正常對照組(1242.597±364.949μmol/L)比較，差異均有顯著性意義(P<0.001)。 五．結(jié)論 (一)、生理鹽水含藥血清組和正常對照組對體外培養(yǎng)滑膜成纖維細胞增殖曲線走勢趨同，均具顯著增殖效應(yīng)。 (二)、三水白虎湯含藥血清和來氟米特含藥血清對體外培養(yǎng)滑膜細胞的增殖有顯著抑制效應(yīng)，該抑制效應(yīng)分別和生理鹽水空白血清組、正常對照組的增殖促進

17、效應(yīng)比較，差異有顯著意義。 (三)、三水白虎湯含藥血清組和來氟米特含藥血清組均能顯著減少培養(yǎng)上清液中一氧化氮的含量，與生理鹽水含藥血清組、正常對照組比較差異有顯著意義。 (四)、復(fù)方中藥三水白虎湯含藥血清法對體外培養(yǎng)滑膜細胞的增殖有明顯抑制效應(yīng)，并且抑制增殖的過程中滑膜細胞分泌一氧化氮同時受到顯著抑制。三水白虎湯有效控制滑膜增生這一途徑可能為三水白虎湯治療熱痹(尤為RA)的重要作用機制之一，抑制滑膜成纖維細胞增生過程顯著抑制其分