腎上腺髓質(zhì)素N端20肽對血管緊張素Ⅱ剌激心肌成纖維細胞增殖、一氧化氮及膠原合成的影響.pdf

1、一.實驗背景心肌重構(gòu)是很多心血管系統(tǒng)疾病發(fā)展演變的共同環(huán)節(jié)，因此研究心肌重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展規(guī)律具有極其重要的意義。實驗證實：心肌重構(gòu)時，心肌成纖維細胞(cardiacfibroblasts，CFs)自身增殖及合成膠原顯著增多，從而導致了心肌間質(zhì)異常增多。近年來的研究表明，CFs能合成一氧化氮(nitrogenoxide，NO)，而NO具有抑制CFs的增殖、膠原合成的功能，在心肌重構(gòu)方面有重要的作用與意義。 血流動力學改變、癌基因異常

2、表達、心肌細胞凋亡、粘附因子以及體液因素等均是心肌重構(gòu)的重要因素，其中血管活性多肽的作用尤為重要。血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAS)系統(tǒng)中極為重要的中間產(chǎn)物，它間接通過影響體循環(huán)血流動力學及血容量，以及直接促心肌肥厚和CFs增殖效應引起心肌重構(gòu)。AngⅡ受體中主要有AT1和AT2兩個亞型，目前認為AT1受體介導心肌細胞生長、肥大、纖維增生；而AT2受體介導心肌細胞調(diào)亡，二者有著密切

3、的關(guān)系。因此，在探索心肌重構(gòu)的機制及治療方案時，AngⅡ一直是研究的熱點。 腎上腺髓質(zhì)素(adrenomedullin，ADM)是Kitamura等從手術(shù)切除的人腎上腺嗜鉻細胞瘤提取物中發(fā)現(xiàn)的一種新的生物活性肽，人ADM的cDNA片段己克隆，共1293bp，翻譯區(qū)可編碼185個氨基酸，此185個氨基酸即腎上腺髓質(zhì)素前體，是進一步合成腎上腺髓質(zhì)原和終產(chǎn)物ADM的前體，它在內(nèi)源性肽酶的作用下裂解為5個片段：(1)信號肽；(2)pro

4、ADM22-41，腎上腺髓質(zhì)素N端20肽(preadrenomedullin-N-20peptide，PAMP)；(3)proADM45-92；(4)pro-ADM95-146，成熟ADM；(5)proADM153-185又稱為腎上腺升壓素(Adrenotensin，ADT)。PAMP與ADM的部分生物學效應相同，但對PAMP研究的較少，特別是PAMP對心肌重構(gòu)影響鮮有報道。Lippton等給麻醉鼠注射大劑量PAMP后，發(fā)現(xiàn)其能降低體循

5、環(huán)動脈壓和外周阻力，而且在發(fā)揮降壓作用同時，也有增加心率與交感神經(jīng)興奮性的作用。動物實驗觀察到自發(fā)性高血壓大鼠心臟和主動脈組織的PAMP濃度較正常血壓大鼠增高；因此本實驗以CFs為研究對象，觀察AngⅡ、PAMP對CFs增殖、膠原合成與NO合成的影響。 二.目的本實驗以體外原代培養(yǎng)SD新生大鼠的心肌成纖維細胞為研究對象，并加入不同濃度的AngⅡ、PAMP進行干預，通過觀察CFs的增殖、合成膠原與NO的情況，來了解PAMP對心肌成

6、纖維細胞的作用。初步探討PAMP在心肌重構(gòu)中的作用及意義。 三.實驗方法采用胰酶消化、差速貼壁培養(yǎng)法，獲得新生SD大鼠的原代CFs，本實驗使用第3代。經(jīng)免疫組化法鑒定，純度為98％；臺盼藍染色細胞活力大于98％。實驗分組為：①空白對照組；②10-9、10-8、10-7、10-6mol/LAngⅡ組；③10-9、10-8、10-7、10-6mol/LPAMP組；④10-7mol/LAngⅡ+PAMP(1019、10-8、10-7、

7、10-6mol/L)組。每個濃度設(shè)6孔。 將CFs制成細胞懸液后按5000個/孔接種于三個96孔板中，使其生長接近融合時，加入含0.5％胎牛血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)24h，使細胞進入生長靜止期。之后按實驗分組設(shè)計加入藥物繼續(xù)培養(yǎng)。 MTT比色法檢測心肌成纖維細胞的增殖。藥物干預72小時后，每孔加入MTT20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h；棄去各孔內(nèi)上清液，并加入150μl二甲基亞砜，振蕩混勻10分鐘使結(jié)晶充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀上4

8、90nm波長處測定光吸收值(A490值)。 采用3H脯氨酸摻入法測定心肌成纖維細胞的膠原合成。藥物培養(yǎng)44小時后，每孔加入3H脯氨酸2μCi和維生素C50μg，4小時后用0.125％胰蛋白酶消化細胞呈細胞懸液，把各孔細胞懸液吸出后依次置入不同的EP管，50000轉(zhuǎn)/秒離心20分種后，用PBS沖洗2次。移入閃爍計數(shù)管中，每管加入閃爍液0.2ml，液態(tài)閃爍計數(shù)儀測定放射性強度。 用硝酸還原法測定NO的含量：加入藥物培養(yǎng)24小

9、時后，將各孔培養(yǎng)液吸入測定管中。具體操作過程按試劑盒說明進行。 四.結(jié)果1.AngⅡ?qū)Fs增殖、膠原及NO合成的影響AngⅡ?qū)Fs增殖的影響：濃度為10-9、10-8、10-7、10-6mol/LAngⅡ作用72h后，MTT比色A490值分別為1.0613±0.0042、1.2413±0.0037、1.4600±0.0033、1.6607±0.0037，各組與對照組(0.9513±0.0046)相比，有顯著性差異(P均＜0.

10、01)。表明AngⅡ可刺激CFs增殖。 AngⅡ?qū)Fs膠原合成的影響：濃度為10-9、10-8、10-7和10-6mol/LAngⅡ組的3H脯氨酸摻入率分別為1487.45±22.72、1581.96±28.42、1939.82±51.94、2599.02±81.27dpm，顯著高于對照組(1400.35±45.75dpm)。 AngⅡ?qū)Fs的NO合成功能的影響：濃度為10-9、10-8、10-7、10-6μmol/

11、LAngⅡ組細胞培養(yǎng)液中NO的濃度是：73.88±2.23、64.34±3.02、54.12±2.82、40.21±1.45μmol/L。各組之間有顯著性差異(P＜0.05)。但空白組與10-9μmol/LAngⅡ之間無顯著性差異(P＞0.05)。表明AngⅡ可抑制CFs合成NO。 2.PAMP對CFs的增殖、膠原及NO合成功能的作用PAMP對CFs增殖的影響：濃度為10-9、10-8、10-7、10-6mol/LPAMP作用7

12、2h后，MTT比色A490值分別為0.9512±0.0053、0.9525±0.0039、0.9510±0.0036、0.9508±0.0057，與對照組(0.9513±0.0046)相比，隨著PAMP濃度的增高，MTT比色A490值無顯著性差異(P均＞0.05)。表明隨著PAMP對CFs的增殖無影響。 PAMP對CFs膠原合成的影響：10-9、10-8、10-7和10-6mol/LPAMP組的3H脯氨酸摻入率分別為1405.3

13、6±44.42、1403.39±35.49、1433.49±49.56、1419.36±43.05dpm，與對照組(1400.35±45.75dpm)相比(P均＞0.05)，各組之間無顯著性差異。表明PAMP對CFs合成膠原無影響。 3.PAMP與AngⅡ共同作用于CFs時，CFs增殖、膠原及NO合成的變化PAMP與AngⅡ共同作用時，CFS增殖的變化：濃度為10-9、10-8、10-7、10-6mol/LPAMP和10-7mo

14、l/LAngⅡ作用72h后，MTT比色A550值分別為：1.4542±0.0039、1.2293±0.0029、1.1333±0.0038、1.0315±0.0033，與對照組(0.9513±0.0046)及10-7mol/LAngⅡ(1.4600±0.0033)相比，隨著PAMP濃度的增高，MTT比色A490值均顯著降低(P＜0.01)。10-7mol/LAngⅡ組與10-7mol/LAngⅡ+10-9mol/LPAMp組之間差異無顯

15、著意義(P＞0.05)，其余各組之間差異均非常顯著(P均＜0.01)。表明PAMP可抑制AngⅡ?qū)Fs的增殖作用。 AngⅡ與PAMP共同作用時對膠原合成功能的影響：濃度為10-9、10-8、10-7和10-6mol/LPAMP+10-7mol/LAngⅡ組的3H脯氨酸摻入率分別為1.4542±0.0039、1.2293±0.0029、1.1333±0.0038、1.0315±0.0033dpm。AngⅡ濃度不變的情況下，隨著

16、PAMP濃度的增高，CFs的3H脯氨酸摻入率呈遞減趨勢，各組之間差異有顯著意義(P＜0.05)。表明PAMP可抑制AngⅡ促CFs的膠原合成作用。 AngⅡ與PAMP共同作用時對NO合成功能的影響：10-7μmol/LAngⅡ+(10-9、10-8、10-7、10-6μmol/L)PAMP組培養(yǎng)液中NO合成濃度分別為66.15±2.95、80.58±3.77、88.67±1.46、96.22±2.96μmol/L，各組間有顯著性