金魚PR55-B家族基因cDNA的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、蛋白質(zhì)的可逆磷酸化修飾，是生物體內(nèi)普遍存在的信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)方式。蛋白磷酸酶行使的去磷酸化作用在調(diào)控細(xì)胞內(nèi)各種生命過程中起了重要的作用。PP2A是主要的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶之一，它參與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生命活動。PR55/B家族是PP2A已知的調(diào)節(jié)亞基家族之一。
　　 本文運(yùn)用RACE和RT-PCR技術(shù)克隆得到金魚PP2A調(diào)節(jié)亞基PR55/B家族中PR55δ，PR55β基因全長序列以及PR55γ基因編碼區(qū)部分

2、序列。結(jié)果顯示PR55δ基因全長2163bp，其中編碼區(qū)1347bp編碼，推測編碼448aa的序列。PR55β基因全長1940bp，其中編碼區(qū)1332bp編碼，推測編碼443aa的序列。PR55γ基因部分cDNA長1218bp，編碼的多肽共含405個氨基酸。通過序列分析發(fā)現(xiàn)PR55/B家族各亞基基因編碼的蛋白與已知其他物種對應(yīng)的蛋白質(zhì)均有著很高的同源性。通過系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建發(fā)現(xiàn)其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與傳統(tǒng)的分類基本一致，符合脊椎動物的進(jìn)化規(guī)律，

3、暗示了該家族基因在進(jìn)化上和功能上的保守性。但是PR55δ和PR55β在氨基末端有顯著差異，可能與各調(diào)節(jié)亞基功能，如決定底物特異性和細(xì)胞內(nèi)定位有關(guān)。運(yùn)用ExPASy和SMART等序列分析軟件在PR55δ、PR55β、PR55γ三個基因推測的蛋白質(zhì)中分別找到了WD40重復(fù)序列結(jié)構(gòu)。PR55/B家族成員在WD40重復(fù)序列上的保守性使我們推測這一結(jié)構(gòu)作為與PP2A結(jié)構(gòu)亞基A相結(jié)合的區(qū)域，為PR55/B家族調(diào)節(jié)亞基參與PP2A三聚體的裝配提供了支

4、點(diǎn)。
　　 在組織表達(dá)方面，金魚PR55/B家族基因呈現(xiàn)明顯的差異性表達(dá)。PR55δ基因的mRNA和蛋白水平都在各個組織中呈現(xiàn)廣泛但不均一的表達(dá)。PR55β基因的mRNA和蛋白表達(dá)僅在大腦和心臟中檢測到。PR55γ基因mRNA特異表達(dá)于在大腦和鰭中。其中，PR55β基因在心臟中的表達(dá)和PR55γ基因在鰭中的表達(dá)是第一次報道。而且金魚(低等脊椎動物)PR55/B在組織中的表達(dá)模式與小鼠(高等脊椎動物)有顯著的差異。這也提示我們PR

5、55β基因可能在魚類(低等脊椎動物)心臟的發(fā)育和心臟組織行駛功能時具有非常重要的作用。而PR55γ基因在調(diào)控金魚鰭的發(fā)育和功能方面也可能具有不可替代的作用。
　　 在金魚胚胎發(fā)育過程中，PR55δ基因的mRNA和蛋白以及PR55β的mRNA基因在胚胎發(fā)育的各個時期都有較高表達(dá)。但是，我們沒有檢測到PR55β基因在蛋白水平上的表達(dá)。PR55δ和PR55β基因在金魚胚胎中的表達(dá)模式與小鼠胚胎中的表達(dá)模式又呈現(xiàn)了明顯的差異，它們可能在

6、調(diào)節(jié)不同物種的發(fā)育中有著不同的作用。PR55γ基因的mRNA在胚胎發(fā)育早期沒有表達(dá)，直到神經(jīng)胚期才開始出現(xiàn)，隨后呈現(xiàn)逐漸升高的表達(dá)模式。PR55γ基因從神經(jīng)胚開始表達(dá)的特點(diǎn)讓我們推測它在神經(jīng)發(fā)育系統(tǒng)中的重要作用。
　　 另外，我們設(shè)計(jì)構(gòu)建PR55δ基因反義表達(dá)載體，通過顯微注射到金魚胚胎來抑制PR55δ基因的表達(dá)，觀察其對胚胎發(fā)育的影響。結(jié)果表明，當(dāng)PR55δ基因表達(dá)下調(diào)后，金魚胚胎出現(xiàn)了不正常的組織器官分化。腦和眼的發(fā)育受到了