PNS對SAMP8小鼠腦內(nèi)Aβ沉淀及記憶相關(guān)信號通路的影響.pdf

1、老年性癡呆(Alzheimer's disease，AD)是以進(jìn)行性學(xué)習(xí)記憶損傷和情感障礙為特征的老年性中樞神經(jīng)退行性疾病。Beta淀粉樣蛋白(β-amyliod protein，Aβ)沉積為AD大腦內(nèi)主要病理學(xué)特征之一，此外AD腦內(nèi)存在多條信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)異常。過量Aβ由其淀粉樣肽前體蛋白(βamyloid protein precursor，APP)經(jīng)α，β，γ-Secretase三種分泌酶代謝紊亂生成。α，β，γ-Secretase

2、活性主要受蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、c-jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase; JNK)信號通路調(diào)控。Aβ則可通過蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Extra cellular signal regulated kinase，ERK)、鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ(calmodulin kinaseⅡ，CaMKⅡ)三條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響cAMP應(yīng)答元件

3、結(jié)合蛋白(cAMP responsive elements binding protein，CREB)磷酸化，抑制腦源性神經(jīng)生長因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)生成，導(dǎo)致神經(jīng)修復(fù)障礙和學(xué)習(xí)記憶損傷。故抑制Aβ形成以及糾正信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常是防治AD的有效干預(yù)手段。
　　三七總皂苷（Panax Notoginseng Saponins，PNS）是中藥三七的主要有效活性成分。我們前期

4、研究表明，PNS能干預(yù)APP基因轉(zhuǎn)錄而抑制APP蛋白的表達(dá)，并通過調(diào)節(jié)α，β，γ-Secretase活性最終減少Aβ的形成，而產(chǎn)生顯著的學(xué)習(xí)記憶保護(hù)作用。本課題繼續(xù)深入探討PNS調(diào)節(jié)α，β，γ-Secretase活性的具體信號通路機(jī)制，同時闡明PNS對抗Aβ神經(jīng)毒性獲得行為學(xué)改善作用的記憶功能相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路機(jī)制。
　　目的:
　　本研究旨在探討PNS能否通過干預(yù)快速老化癡呆模型小鼠(SenescenceAccelerate

5、d Mice Prone8，SAMP8)大腦PKC、JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)腦內(nèi)α，β,γ-Secretase水平而抑制Aβ蛋白生成，并進(jìn)一步探討能否通過干預(yù)PKA、ERK、CaMKⅡ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，對抗Aβ?lián)p傷大腦海馬神經(jīng)所致學(xué)習(xí)記憶障礙，闡明PNS保護(hù)學(xué)習(xí)記憶損傷的作用機(jī)制，以期為開發(fā)PNS應(yīng)用于AD等中樞神經(jīng)退行性疾病的防治提供基礎(chǔ)理論和實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1.本研究采用源自AKR/J系的快速自然老化小鼠SAMP

6、8作為實驗動物模型。共60只雄性SAMP8小鼠隨機(jī)分為模型組(Model group)、PNS低劑量組（L-PNS group）、PNS高劑量組(H-group)、以及石杉堿甲陽性對照組(Hup-A group)，每組15只。PNS低劑量組按100mg/kg體重給藥;PNS高劑量組按200mg/kg體重給藥;石杉堿甲組按0.3mg/kg體重給藥。PNS、石杉堿甲以雙蒸水調(diào)配后灌胃給藥。模型組給予給藥組相同容積的雙蒸水灌胃。每天灌胃1次，

7、連續(xù)給藥2個月。
　　2.采用經(jīng)典MWM水迷宮（Morris Water Maze，MWM）程序（定位航行實驗和空間探索實驗）檢測SAMP8小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能，中性紅尼氏染色對實驗動物的大腦海馬進(jìn)行病理學(xué)和形態(tài)計量學(xué)分析，酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linkedimmunosorbent assay, ELISA)雙抗體夾心法檢測腦內(nèi)Aβ1-42蛋白水平。探討PNS對SAMP8小鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙及Aβ生成、海馬神經(jīng)損傷的保

8、護(hù)作用。
　　3.運用化學(xué)分光光度法直接檢測SAMP8小鼠大腦內(nèi)PKC、JNK1/2/3酶活性，免疫印跡(Western Blotting，WB)檢測PKC(cPKC-βⅡ)蛋白、phospho-p46/54 MAPK(p-JNK1/2/3)蛋白表達(dá)水平，實時定量RT-PCR(Real-time reverse transcriptionquantitative polymerase chain reation，Real-time

9、 RT-PCR)技術(shù)定量檢測PKC(cPKC-βⅠ/Ⅱ)mRNA、p46 MAPK(JNK1) mRNA水平，探討PNS對SAMP8小鼠腦內(nèi)PKC、JNK信號通路的干預(yù)作用。同時采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移法(Fluorescence ResonanceEnergy Transfer, FRET)檢測α，β,γ-Secretase活性，Westem Blotting檢測ADAM10(α-Secretase)、BACE1(β-Secretase)

10、、Aph-1（γ-Secretase）蛋白表達(dá)水平，Real-timeRT-PCR技術(shù)定量檢測ADAM10、BACE1、Aph-1蛋白mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，探討PNS通過調(diào)節(jié)PKC、JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路干預(yù)α，β，γ-Secretase三個關(guān)鍵分泌酶進(jìn)而抑制Aβ蛋白生成的可能機(jī)制。
　　4.運用化學(xué)分光光度法檢測SAMP8小鼠大腦內(nèi)PKA、ERK1/2MAPK、CaMKⅡ各蛋白激酶活性，Western Blotting檢測PKARIα

11、（PKA調(diào)節(jié)亞基Ⅰα）蛋白、phospho-p44/42 MAPK(p-ERK1/2)蛋白、p-CaMKⅡα/β蛋白表達(dá)水平，Real-timeRT-PCR定量檢測PKARIα mRNA、p42 MAPK（ERK2）mRNA、CaMKⅡαmRNA的水平，探討PNS對SAMP8小鼠腦內(nèi)PKA、ERK、CaMKⅡ信號通路的干預(yù)作用。同時進(jìn)一步以Westem Blotting檢測p-CREB、BDNF蛋白表達(dá)水平，Real-time RT-P

12、CR定量檢測CREB、BDNF mRNA的水平，探討PNS通過干預(yù)PKA、ERK、CaMKⅡ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，影響CREB、BDNF因子轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平，對抗Aβ蛋白神經(jīng)毒性保護(hù)學(xué)習(xí)記憶功能的可能機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1.PNS對SAMP8小鼠大腦Aβ生成、海馬神經(jīng)損傷及空間學(xué)習(xí)記憶保護(hù)作用的研究
　　研究結(jié)果表明，PNS能顯著降低SAMP8小鼠大腦Aβ1-42水平，減輕海馬神經(jīng)病理損傷，增加海馬神經(jīng)元胞體數(shù)量，有效改

13、善SAMP8小鼠所呈現(xiàn)的空間學(xué)習(xí)記憶障礙。表明PNS具有較好的保護(hù)神經(jīng)損傷和認(rèn)知功能障礙的作用，此作用可能與其減少Aβ生成，降低大腦內(nèi)Aβ水平有關(guān)。結(jié)果如下:
　　模型組SAMP8小鼠大腦Aβ1-42水平顯著高于其他各用藥組(P＜0.01)，PNS高劑量組與石杉堿甲組無顯著差異(P＞0.05)，均明顯低于PNS低劑量組。模型組SAMP8小鼠海馬神經(jīng)元胞體數(shù)量顯著低于其他三組(P＜0.01)，PNS低、高劑量組顯著低于石杉堿甲組(P

14、＜0.01)，PNS高劑量組顯著高于低劑量組(P＜0.01)。MWM水迷宮定位航行實驗，逃避潛伏期5天總體比較，模型組和PNS低劑量組顯著高于PNS高劑量組和石杉堿甲組(P＜0.01)，模型組和PNS低劑量組無顯著差異(P＞0.05)，PNS高劑量組和石杉堿甲組無顯著差異(P＞0.05)。平臺象限游泳時間百分比的5天總體比較結(jié)果顯示，各用藥組顯著高于模型組(P＜0.01)，PNS低劑量組明顯低于PNS高劑量組和石杉堿甲組(P＜0.01)

15、。PNS高劑量組和石杉堿甲組無顯著差異(P＞0.05)?？臻g探索實驗，各組原平臺象限游泳時間比較，PNS高劑量組、石杉堿甲組顯著高于模型組(P＜0.01)，低劑量組與模型組無顯著性差異(P＞0.05)、且與PNS高劑量組、石杉堿甲組亦無顯著性差異(P＞0.05)，高劑量組與石杉堿甲組無顯著性差異(P＞0.05)?？缭皆脚_次數(shù)比較，PNS高劑量組和石杉堿甲組顯著高于模型組（P＜0.01），PNS低劑量組高于模型組(P＜0.05)、但低于

16、高劑量組(P＜0.05)和石杉堿甲組(P＜0.01)，高劑量組和石杉堿甲組無顯著差異(P＞0.05)。
　　2.PNS減少SAMP8小鼠大腦Aβ生成的相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作用機(jī)制研究
　　研究結(jié)果表明，PNS能顯著提高SAMP8小鼠大腦cPKC-βⅠ/Ⅱ mRNA、cPKC-βⅡ蛋白以及PKC酶活性水平，同時增強(qiáng)ADAM10 mRNA、ADAM10蛋白表達(dá)以及α-Secretase的活性，抑制BACE1 mRNA、BACE1蛋白

17、表達(dá)以及β-Secretase活性。此外，結(jié)果顯示PNS還顯著降低p46 MAPK(JNK1)mRNA、phospho-p46 MAPK(p-JNK1)蛋白表達(dá)及JNK1酶活性，抑制Aph-1 mRNA、Aph-1蛋白表達(dá)以及γ-Secretase活性。提示PNS可通過促進(jìn)PKC信號通路活化，增強(qiáng)α-Secretase并抑制β-Secretase的活性與表達(dá)，同時通過抑制JNK信號通路抑制γ-Secretase的活性與表達(dá)，最終減少Aβ

18、蛋白生成。結(jié)果如下:
　　模型組PKC活性明顯低于PNS高劑量與石杉堿甲組(P＜0.01)，模型組與PNS低劑量組比較無顯著差異(P＞0.05)。石杉堿甲組與PNS高劑量組之間比較無顯著差異(P＞0.05)。模型組典型PKC(classicalor conventional PKC，cPKC) betaⅠ/Ⅱ亞類（cPKC-βⅠ/Ⅱ）mRNA水平明顯低于其他各組(P＜0.01)，PNS高劑量與石杉堿甲組間無顯著差異(P＞0.05)

19、。石杉堿甲組與PNS高劑量組betaⅡ亞類cPKC(cPKC-βⅡ)蛋白表達(dá)量明顯高于模型組和PNS低劑量組(P＜0.01)，石杉堿甲組與PNS高劑量組之間無明顯差異(P＞0.05)，模型組和PNS低劑量組比較無明顯差異(P＞0.05)。
　　模型組JNK1酶活性明顯高于PNS高劑量組和石杉堿甲組(P＜0.01)，低劑量組與模型組無顯著差異(P＞0.05)，PNS高劑量組與石杉堿甲組無顯著差異(P＞0.05)。JNK2、JNK3在

20、四組間兩兩比較均無顯著差異(P＞0.05)。模型組p46MAPK(JNK1)mRNA水平顯著高于其他各組(P＜0.01)，PNS低劑量組顯著高于PNS高劑量與石杉堿甲組(P＜0.01)，PNS高劑量與石杉堿甲組間無顯著差異（P＞0.05）。模型組 phospho-p46MAPK(p-JNK1)蛋白表達(dá)水平明顯高于其他各組(P＜0.01)，石杉堿甲組、PNS高劑量組、PNS低劑量組之間無明顯差異(P＞0.05)。
　　模型組α-Se

21、cretase活性顯著低于PNS高劑量組和石杉堿甲組（P＜0.01），β-Secretase、γ-Secretase活性顯著高于其他各組(P＜0.01)，PNS高劑量組和石杉堿甲組兩組間無顯著差異（P＞0.05）。模型組ADAM10 mRNA水平顯著低于PNS高劑量組和石杉堿甲組(P＜0.01)，PNS低劑量組與模型組無明顯差異(P＞0.05)，高劑量組和石杉堿甲組無明顯差異(P＞0.05)。模型組BACE1 mRNA水平顯著高于PNS

22、低劑量組(P＜0.05)、以及PNS高劑量組和石杉堿甲組(P＜0.01)，PNS、低高劑量組顯著高于石杉堿甲組(P＜0.05)。模型組Aph-1 mRNA水平顯著高于其他各組(P＜0.01)，PNS高劑量組和石杉堿甲組無明顯差異(P＞0.05)。石杉堿甲組與PNS高劑量組ADAM10蛋白表達(dá)量明顯高于模型組和PNS低劑量組(P＜0.01)，石杉堿甲組高于PNS高劑量組(P＜0.01)，模型組和PNS低劑量組比較無明顯差異（P＞0.05）

23、。石杉堿甲組與PNS高劑量組BACE1、Aph-1蛋白表達(dá)量明顯低于模型組和PNS低劑量組(P＜0.01)，石杉堿甲組與PNS高劑量組之間無明顯差異(P＞0.05)，模型組和PNS低劑量組比較無明顯差異(P＞0.05)。
　　3.PNS抗Aβ?lián)p傷大腦海馬神經(jīng)保護(hù)學(xué)習(xí)記憶功能的相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路機(jī)制研究
　　研究結(jié)果顯示，PNS能顯著提高SAMP8小鼠大腦PKA、ERK1/2 MAPK、CaMKⅡ各蛋白激酶的活性，增加PKARI

24、α、p-ERK2、CaMKⅡαmRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平，且同時提高腦內(nèi)p-CREB、BDNF因子mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平。提示PNS可通過干預(yù)PKA、ERK、CaMKⅡ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，活化CREB，促進(jìn)BDNF合成，有效保護(hù)Aβ蛋白誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷和認(rèn)知損害。結(jié)果如下:
　　模型組PKA活性顯著低于PNS低劑量組(P＜0.05)和PNS高劑量和石杉堿甲組(P＜0.01)，PNS低劑量組顯著低于PNS高劑量和石杉堿甲組(P＜0.01

25、)，PNS高劑量組和石杉堿甲組比較無顯著差異(P＞0.05)。模型組PKARIα(PKA調(diào)節(jié)亞基RIα)mRNA水平顯著降低，PNS高劑量與石杉堿甲組顯著高于模型組(P＜0.01)，PNS高劑量與石杉堿甲組間無顯著差異(P＞0.05)，PNS低劑量組與模型組間無顯著差異(P＞0.05)。石杉堿甲組與PNS高劑量組PKARIα蛋白表達(dá)量明顯高于模型組和低劑量組(P＜0.01)，石杉堿甲組與PNS高劑量組之間無明顯差異(P＞0.05)，模型

26、組和低劑量組比較無明顯差異（P＞0.05）。
　　模型組ERK1/2 MAPK酶特異活性顯著低于其他各組(P＜0.01)，PNS高、低劑量組、石杉堿甲組兩兩比較無顯著差異(P＞0.05)。模型組p42 MAPK(ERK2) mRNA水平顯著低于其他各組(P＜0.01)，PNS低劑量組低于PNS高劑量(P＜0.01)與石杉堿甲組（P＜0.05）。PNS高劑量與石杉堿甲組間無顯著差異(P＞0.05)。模型組phospho-p44/42

27、 MAPK(p-ERK1/2)蛋白表達(dá)水平顯著低于其他各組(P＜0.01)，石杉堿甲組明顯高于PNS低劑量組(P＜0.01)和PNS高劑量組(P＜0.05)，PNS高劑量組明顯高于PNS低劑量組(P＜0.01)。
　　CaMKⅡ酶活性比較，模型組顯著低于其他各組(P＜0.01)，PNS低劑量組低于高劑量和石杉堿甲組(P＜0.01)，PNS高劑量與石杉堿甲組無顯著差異(P＞0.05)。模型組CaMKⅡα mRNA水平最低，與其他各組

28、差異顯著(P＜0.01)，PNS高劑量與石杉堿甲組較PNS低劑量組更高（P＜0.01），PNS高劑量與石杉堿甲組間無顯著差異(P＞0.05)。石杉堿甲組與PNS高劑量組p-CaMKⅡα/β蛋白表達(dá)量明顯高于模型組和低劑量組(P＜0.01)，石杉堿甲組高于PNS高劑量組(P＜0.01)，模型組和低劑量組比較無明顯差異(P＞0.05)。
　　模型組CREB mRNA水平明顯低于其他各組(P＜0.01)。PNS低劑量組低于PNS高劑量與

29、石杉堿甲組較高(P＜0.01)。PNS高劑量與石杉堿甲組間無顯著差異(P＞0.05)。模型組p-CREB蛋白水平明顯低于PNS高劑量組(P＜0.01)和石杉堿甲組(P＜0.05)，PNS低劑量組和模型組比較無明顯差異(P＞0.05)，石杉堿甲組與PNS高劑量組之間無明顯差異(P＞0.05)。
　　模型組BDNF mRNA水平顯著低于其他各組(P＜0.01)，PNS低劑量組低于PNS高劑量與石杉堿甲組(P＜0.01)，PNS高劑量與

30、石杉堿甲組間無顯著差異(P＞0.05)。石杉堿甲組與PNS高劑量組BDNF蛋白水平明顯高于模型組和低劑量組（P＜0.01），石杉堿甲組與PNS高劑量組之間無明顯差異(P＞0.05)，模型組和低劑量組比較無明顯差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.PNS具有保護(hù)大腦海馬神經(jīng)損傷，改善SAMP8小鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙作用，該作用與其減少Aβ蛋白生成，以及抗Aβ蛋白神經(jīng)毒性密切相關(guān)。
　　2.PNS能增強(qiáng)SAMP8小鼠大

31、腦α-Secretase基因與蛋白表達(dá)和活化，是其減少Aβ蛋白生成的主要機(jī)制之一，該作用與PNS能促進(jìn)α-Secretase相關(guān)的PKC信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化密切相關(guān)。
　　3.PNS能抑制SAMP8小鼠大腦β-Secretase基因與蛋白表達(dá)和活化，是其減少Aβ蛋白生成的主要機(jī)制之二，該作用與PNS能促進(jìn)β-Secretase相關(guān)的PKC信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化密切相關(guān)。
　　4.PNS能抑制SAMP8小鼠大腦γ-Secretase基因

32、與蛋白表達(dá)和活化，是其減少Aβ蛋白生成的機(jī)制之三，該作用與PNS能抑制γ-Secretase相關(guān)的JNK信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)。
　　5.PNS能增強(qiáng)p-CREB、BDNF因子基因與蛋白的表達(dá)，是PNS保護(hù)大腦海馬神經(jīng)損傷的重要機(jī)制之一，也是PNS保護(hù)大腦長時程增強(qiáng)(Long-term potentiation，LTP)受損，改善學(xué)習(xí)記憶障礙的重要機(jī)理。
　　6.PNS增強(qiáng)p-CREB、BDNF因子基因與蛋白的表達(dá)，與其促進(jìn)相