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文檔簡介
1、目的:以原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經元為研究對象,觀察睪酮(T)、雙氫睪酮(DHT)和睪酮-牛血清白蛋白(T-BSA)對原代海馬神經元樹突棘的密度和形態(tài)以及突觸蛋白PSD95和SYN的快速作用,探討雄激素非基因組效應對海馬神經元突觸形態(tài)可塑性的影響。
方法:
1.基于樹突棘形態(tài)學觀察的大鼠原代海馬神經元轉染GFP方法的優(yōu)化。選用孕18 d的SD大鼠,解剖胎鼠腦組織,分離海馬,進行海馬神經元的培養(yǎng)。應用Lipofectami
2、ne2000和慢病毒兩種轉染方法對體外培養(yǎng)8 d的SD大鼠海馬神經元進行綠色熒光蛋白GFP質粒轉染,觀察海馬神經元轉染效率和熒光表達情況,并用臺盼藍染色檢測神經元的存活率;之后,采用優(yōu)選出的轉染方法對體外培養(yǎng)8d的海馬神經元進行轉染,觀察轉染后培養(yǎng)至10 d、15 d、20 d和25 d不同時間海馬神經元樹突棘的生長發(fā)育情況;最后,觀察8 d、12 d和16 d不同時間轉染對海馬神經元樹突棘形態(tài)的影響。
2.雄激素對大鼠原代海
3、馬神經元樹突棘形態(tài)以及密度和表面積的快速影響。大鼠原代海馬神經元培養(yǎng)。選取優(yōu)化的轉染方法 Lipofectamine2000對海馬神經元進行GFP轉染,培養(yǎng)至第20 d時,利用共聚焦顯微鏡和活細胞工作站對轉染成功且狀態(tài)良好的海馬神經元樹突棘進行活細胞成像觀察。實驗隨機分為4組:對照組(Con組)、T組、DHT組和T-BSA組。根據(jù)參考文獻和預實驗結果, T組和DHT組藥物作用濃度為10 nM, T-BSA組為0.36 nM,Con組給予
4、等量的二甲基亞砜。利用激光共聚焦顯微鏡觀察藥物干預前后樹突棘的形態(tài)變化并記錄樹突棘的密度和表面積。每隔30 min掃描拍照一次,共觀察120 min。
3.雄激素對大鼠原代海馬神經元突觸蛋白 PSD95和 SYN的快速影響。大鼠原代海馬神經元培養(yǎng)。培養(yǎng)至第20 d時,進行實驗。實驗分組和藥物作用濃度同上一部分。根據(jù)預實驗結果,藥物作用時間為60 min。給藥結束后,應用免疫熒光細胞染色方法,激光共聚焦顯微鏡對突觸蛋白PSD95
5、和SYN進行觀察。
結果:
1.基于樹突棘形態(tài)學觀察的大鼠原代海馬神經元轉染GFP方法的優(yōu)化。對于樹突棘形態(tài)學觀察而言,Lipofectamine2000轉染效果優(yōu)于慢病毒,Lipofectamine2000轉染效率為5.21%,低于慢病毒轉染效率82.53%。但就轉染前后神經元存活率而言,Lipofectamine2000轉染后24 h存活率為93.78%,高于慢病毒轉染后24 h存活率83.37%。轉染1 w后,
6、 Lipofectamine2000轉染存活率為91.59%,顯著高于慢病毒轉染存活率72.92%;且Lipofectamine2000轉染成功的神經元生長狀態(tài)也優(yōu)于慢病毒轉染組。海馬神經元培養(yǎng)至20 d時,樹突棘發(fā)育較成熟,絲狀偽足明顯減少,形成密集的短粗狀或蘑菇狀的樹突棘。12 d時進行轉染是進行樹突棘形態(tài)學觀察的最佳轉染時間;細胞培養(yǎng)至20 d時熒光表達較好,樹突棘形態(tài)清晰可見,適合進行活細胞樹突棘長時間形態(tài)學觀察。
2
7、.雄激素對大鼠原代海馬神經元樹突棘形態(tài)以及密度和表面積的快速影響。
樹突棘形態(tài):各組樹突棘形態(tài)多樣,蘑菇狀、短粗狀、細桿狀等各種形狀的樹突棘可以在同一時間的同一樹突上被發(fā)現(xiàn),而且樹突棘的形態(tài)不是固定不變的。在觀察的時間內,樹突棘的形態(tài)不是固定不變的。各組相比,Con組的樹突棘形態(tài)相對穩(wěn)定,沒有明顯的變化。其它三組給藥后,一些樹突棘形態(tài)有了較明顯的變化,更趨于成熟,表現(xiàn)為由細桿型變成短粗型或者由短粗型變成蘑菇型。
樹突
8、棘密度:在120 min的觀察時間內,Con組、T組、DHT組和T-BSA組樹突棘密度變化無統(tǒng)計學差異。
樹突棘表面積:Con組樹突棘的表面積隨著時間的改變,相對穩(wěn)定變化不大。T組、DHT組和T-BSA組樹突棘的表面積隨著時間的改變,呈現(xiàn)一定的變化。在60 min時,與Con組(1.27±0.41)相比,T組(2.47±0.64)、DHT組(2.68±1.08)和T-BSA組(2.61±0.67)樹突棘表面積變化差異有統(tǒng)計學意
9、義。在90 min時,與Con組(1.41±0.31)相比,T組(2.41±0.52)、DHT組(2.58±0.80)和T-BSA組(2.38±0.60)樹突棘表面積變化差異有統(tǒng)計學意義。其中,給藥60 min時,差異最顯著。其余各時間段差異無統(tǒng)計學意義。T組、DHT組和T-BSA組三組之間樹突棘表面積變化無統(tǒng)計學差異。
3.雄激素對大鼠原代海馬神經元突觸蛋白 PSD95和 SYN的快速影響。
PSD95免疫熒光細胞
10、化學染色結果顯示:與Con組(63.60±2.06)相比,T組(90.78±2.83)、DHT組(85.48±2.41)和T-BSA組(88.42±3.40)突觸蛋白PSD95的熒光強度都有所增加,差異有統(tǒng)計學意義。T組、DHT組和T-BSA組三組之間PSD95熒光強度無統(tǒng)計學差異。
SYN免疫熒光細胞化學染色結果顯示:與Con組(52.96±0.97)相比, T組(63.02±0.66)、DHT組(65.00±1.46)和T
11、-BSA組(63.47±1.05)突觸蛋白SYN的熒光強度都有所增加,差異有統(tǒng)計學意義。T組、DHT組和 T-BSA組三組之間 SYN熒光強度無統(tǒng)計學差異。
結論:
1.基于樹突棘形態(tài)學觀察的目的,用Lipofectamine2000轉染GFP方法對培養(yǎng)12 d的原代海馬神經元進行轉染后培養(yǎng)至20 d時進行樹突棘形態(tài)學觀察效果良好。
2.雄激素在短時間內未能增加大鼠原代海馬神經元樹突棘密度,但影響了樹突棘形
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