雄激素對(duì)原代海馬神經(jīng)元樹(shù)突棘及突觸蛋白的快速作用.pdf

1、目的：以原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元為研究對(duì)象，觀察睪酮（T）、雙氫睪酮（DHT）和睪酮-牛血清白蛋白（T-BSA）對(duì)原代海馬神經(jīng)元樹(shù)突棘的密度和形態(tài)以及突觸蛋白PSD95和SYN的快速作用，探討雄激素非基因組效應(yīng)對(duì)海馬神經(jīng)元突觸形態(tài)可塑性的影響。
　　方法：
　　1.基于樹(shù)突棘形態(tài)學(xué)觀察的大鼠原代海馬神經(jīng)元轉(zhuǎn)染GFP方法的優(yōu)化。選用孕18 d的SD大鼠，解剖胎鼠腦組織，分離海馬，進(jìn)行海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)。應(yīng)用Lipofectami

2、ne2000和慢病毒兩種轉(zhuǎn)染方法對(duì)體外培養(yǎng)8 d的SD大鼠海馬神經(jīng)元進(jìn)行綠色熒光蛋白GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，觀察海馬神經(jīng)元轉(zhuǎn)染效率和熒光表達(dá)情況，并用臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)神經(jīng)元的存活率；之后，采用優(yōu)選出的轉(zhuǎn)染方法對(duì)體外培養(yǎng)8d的海馬神經(jīng)元進(jìn)行轉(zhuǎn)染，觀察轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)至10 d、15 d、20 d和25 d不同時(shí)間海馬神經(jīng)元樹(shù)突棘的生長(zhǎng)發(fā)育情況；最后，觀察8 d、12 d和16 d不同時(shí)間轉(zhuǎn)染對(duì)海馬神經(jīng)元樹(shù)突棘形態(tài)的影響。
　　2.雄激素對(duì)大鼠原代海

3、馬神經(jīng)元樹(shù)突棘形態(tài)以及密度和表面積的快速影響。大鼠原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)。選取優(yōu)化的轉(zhuǎn)染方法 Lipofectamine2000對(duì)海馬神經(jīng)元進(jìn)行GFP轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)至第20 d時(shí)，利用共聚焦顯微鏡和活細(xì)胞工作站對(duì)轉(zhuǎn)染成功且狀態(tài)良好的海馬神經(jīng)元樹(shù)突棘進(jìn)行活細(xì)胞成像觀察。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為4組：對(duì)照組（Con組）、T組、DHT組和T-BSA組。根據(jù)參考文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果， T組和DHT組藥物作用濃度為10 nM， T-BSA組為0.36 nM，Con組給予

4、等量的二甲基亞砜。利用激光共聚焦顯微鏡觀察藥物干預(yù)前后樹(shù)突棘的形態(tài)變化并記錄樹(shù)突棘的密度和表面積。每隔30 min掃描拍照一次，共觀察120 min。
　　3.雄激素對(duì)大鼠原代海馬神經(jīng)元突觸蛋白 PSD95和 SYN的快速影響。大鼠原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)。培養(yǎng)至第20 d時(shí)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組和藥物作用濃度同上一部分。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，藥物作用時(shí)間為60 min。給藥結(jié)束后，應(yīng)用免疫熒光細(xì)胞染色方法，激光共聚焦顯微鏡對(duì)突觸蛋白PSD95

5、和SYN進(jìn)行觀察。
　　結(jié)果：
　　1.基于樹(shù)突棘形態(tài)學(xué)觀察的大鼠原代海馬神經(jīng)元轉(zhuǎn)染GFP方法的優(yōu)化。對(duì)于樹(shù)突棘形態(tài)學(xué)觀察而言，Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染效果優(yōu)于慢病毒，Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染效率為5.21％，低于慢病毒轉(zhuǎn)染效率82.53%。但就轉(zhuǎn)染前后神經(jīng)元存活率而言，Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染后24 h存活率為93.78%，高于慢病毒轉(zhuǎn)染后24 h存活率83.37%。轉(zhuǎn)染1 w后，

6、 Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染存活率為91.59%，顯著高于慢病毒轉(zhuǎn)染存活率72.92%；且Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染成功的神經(jīng)元生長(zhǎng)狀態(tài)也優(yōu)于慢病毒轉(zhuǎn)染組。海馬神經(jīng)元培養(yǎng)至20 d時(shí)，樹(shù)突棘發(fā)育較成熟，絲狀偽足明顯減少，形成密集的短粗狀或蘑菇狀的樹(shù)突棘。12 d時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染是進(jìn)行樹(shù)突棘形態(tài)學(xué)觀察的最佳轉(zhuǎn)染時(shí)間；細(xì)胞培養(yǎng)至20 d時(shí)熒光表達(dá)較好，樹(shù)突棘形態(tài)清晰可見(jiàn)，適合進(jìn)行活細(xì)胞樹(shù)突棘長(zhǎng)時(shí)間形態(tài)學(xué)觀察。
　　2

7、.雄激素對(duì)大鼠原代海馬神經(jīng)元樹(shù)突棘形態(tài)以及密度和表面積的快速影響。
　　樹(shù)突棘形態(tài)：各組樹(shù)突棘形態(tài)多樣，蘑菇狀、短粗狀、細(xì)桿狀等各種形狀的樹(shù)突棘可以在同一時(shí)間的同一樹(shù)突上被發(fā)現(xiàn)，而且樹(shù)突棘的形態(tài)不是固定不變的。在觀察的時(shí)間內(nèi)，樹(shù)突棘的形態(tài)不是固定不變的。各組相比，Con組的樹(shù)突棘形態(tài)相對(duì)穩(wěn)定，沒(méi)有明顯的變化。其它三組給藥后，一些樹(shù)突棘形態(tài)有了較明顯的變化，更趨于成熟，表現(xiàn)為由細(xì)桿型變成短粗型或者由短粗型變成蘑菇型。
　　樹(shù)突

8、棘密度：在120 min的觀察時(shí)間內(nèi)，Con組、T組、DHT組和T-BSA組樹(shù)突棘密度變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　樹(shù)突棘表面積：Con組樹(shù)突棘的表面積隨著時(shí)間的改變，相對(duì)穩(wěn)定變化不大。T組、DHT組和T-BSA組樹(shù)突棘的表面積隨著時(shí)間的改變，呈現(xiàn)一定的變化。在60 min時(shí)，與Con組（1.27±0.41）相比，T組（2.47±0.64）、DHT組（2.68±1.08）和T-BSA組（2.61±0.67）樹(shù)突棘表面積變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

9、義。在90 min時(shí)，與Con組（1.41±0.31）相比，T組（2.41±0.52）、DHT組（2.58±0.80）和T-BSA組（2.38±0.60）樹(shù)突棘表面積變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，給藥60 min時(shí)，差異最顯著。其余各時(shí)間段差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。T組、DHT組和T-BSA組三組之間樹(shù)突棘表面積變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3.雄激素對(duì)大鼠原代海馬神經(jīng)元突觸蛋白 PSD95和 SYN的快速影響。
　　PSD95免疫熒光細(xì)胞

10、化學(xué)染色結(jié)果顯示：與Con組（63.60±2.06）相比，T組（90.78±2.83）、DHT組（85.48±2.41）和T-BSA組（88.42±3.40）突觸蛋白PSD95的熒光強(qiáng)度都有所增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。T組、DHT組和T-BSA組三組之間PSD95熒光強(qiáng)度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　SYN免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示：與Con組（52.96±0.97）相比， T組（63.02±0.66）、DHT組（65.00±1.46）和T

11、-BSA組（63.47±1.05）突觸蛋白SYN的熒光強(qiáng)度都有所增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。T組、DHT組和 T-BSA組三組之間 SYN熒光強(qiáng)度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：
　　1.基于樹(shù)突棘形態(tài)學(xué)觀察的目的，用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染GFP方法對(duì)培養(yǎng)12 d的原代海馬神經(jīng)元進(jìn)行轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)至20 d時(shí)進(jìn)行樹(shù)突棘形態(tài)學(xué)觀察效果良好。
　　2.雄激素在短時(shí)間內(nèi)未能增加大鼠原代海馬神經(jīng)元樹(shù)突棘密度，但影響了樹(shù)突棘形