缺血后處理調(diào)控心肌細胞凋亡的分子靶點研究.pdf

1、研究背景：
　　調(diào)動機體內(nèi)源性保護機制，增加機體的抗損傷能力是預防和治療缺血/再灌注心臟損傷的重要措施之一。缺血后處理是于組織長期缺血后、再灌注之前進行反復短暫的再灌注/缺血處理，以減輕缺血/再灌注所致的組織損傷的一種方法，是迄今已知最強的內(nèi)源性細胞保護現(xiàn)象之一。但是其保護機制的分子靶點尚不清楚。
　　線粒體凋亡途徑是缺血/再灌注誘導心肌細胞凋亡，造成心肌損傷的主要途徑。而抑制心肌細胞凋亡又是缺血后處理保護心肌的關鍵所在。由

2、此產(chǎn)生的問題是：缺血后處理是否通過調(diào)控參與線粒體凋亡途徑的關鍵分子來發(fā)揮作用呢？PUMA（p53upregulatedmodulatorofapoptosis）是位于線粒體的p53靶基因，它具有強大的促凋亡功能。ARC是迄今為止在心臟發(fā)現(xiàn)的高度特異，且大量表達的抗凋亡蛋白，其全稱是帶有caspase富集功能域的凋亡抑制因子（apoptosisrepressorwithacaspaserecuitmentdomain，簡稱ARC）。研究已

3、經(jīng)證實ARC和PUMA是調(diào)控線粒體凋亡途徑的重要分子。既然缺血后處理具有明確的抗線粒體凋亡途徑的作用，而PUMA和ARC的促凋亡作用和抗凋亡作用又是以線粒體為靶點實現(xiàn)的，那么，缺血后處理是否以PUMA和ARC為靶分子，通過抑制線粒體凋亡途徑實現(xiàn)其心肌保護作用呢？目前尚不清楚。
　　研究目的：
　　采用體外培養(yǎng)的乳大鼠心肌細胞缺氧后處理模型（模擬整體水平缺血后處理模型），研究調(diào)控PUMA和ARC表達與缺氧后處理抑制線粒體凋亡途

4、徑的關系，證實缺氧后處理通過下調(diào)PUMA的表達、上調(diào)ARC的表達，抑制線粒體凋亡途徑，實現(xiàn)其心肌保護作用。
　　研究方法：
　　1.乳大鼠心肌細胞缺氧/復氧和缺氧后處理模型的建立：培養(yǎng)的乳大鼠心肌細胞臵于缺氧倉中缺氧3h后，持續(xù)復氧3h復制缺氧/復氧模型。培養(yǎng)的乳大鼠心肌細胞臵于缺氧倉中缺氧3h后，持續(xù)復氧之前進行3次反復短暫的復氧/缺氧處理，復制缺氧后處理模型。
　　2.心肌細胞凋亡的研究：用PropidiumIod

5、ide和Annexin-V標記心肌細胞，采用流式細胞儀檢測法研究心肌細胞凋亡的變化。
　　3.心肌細胞死亡率的研究：用臺盼藍染色法研究心肌細胞死亡的變化。
　　4.檢測PUMA和ARC蛋白表達：提取心肌細胞總蛋白，采用Westernblot方法研究PUMA和ARC蛋白表達的變化。
　　5.檢測細胞色素c和Bax在線粒體和胞漿中的表達：提取心肌細胞線粒體和胞漿，采用Westernblot方法研究細胞色素c和Bax表達的變

6、化。
　　6.caspase-3活性的檢測：采用caspase-3活性檢測試劑盒研究caspase-3活性的變化。
　　7.數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學分析：各組實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x±s)表示，以統(tǒng)計學軟件SPSS13.0分析，多組間兩兩比較用Bonferroni’stest，P<0.05認為具有顯著性差異。
　　實驗結(jié)果：
　　1.缺氧后處理下調(diào)PUMA，減輕心肌細胞缺氧/復氧損傷
　?。?）缺氧/復氧上調(diào)PU

7、MA，誘導心肌細胞凋亡：與常氧培養(yǎng)的對照組比較，缺氧/復氧誘導心肌細胞PUMAmRNA和蛋白表達明顯上調(diào)（P<0.001），與此同時，心肌細胞凋亡率和的死亡率明顯高于對照組（P<0.001）。而用siRNA抑制內(nèi)源性PUMA的表達后再進行缺氧/復氧，心肌細胞凋亡率和死亡率明顯降低，與單純?nèi)毖?復氧組比較，差異顯著（P<0.001）。
　?。?）缺氧后處理通過抑制PUMA表達減輕心肌細胞缺氧/復氧損傷：在心肌細胞缺氧后復氧前進行3次

8、反復短暫的復氧/缺氧處理，以復制缺氧后處理模型，研究缺氧后處理條件下PUMAmRNA和蛋白表達以及心肌細胞的凋亡率和死亡率的變化。結(jié)果顯示：缺氧后處理明顯下調(diào)缺氧/復氧誘導的PUMAmRNA和蛋白表達（與缺氧/復氧比較P<0.001）。與之相應的是，給予缺氧后處理的心肌細胞凋亡率和死亡率明顯減少（與缺氧/復氧比較P<0.001）。但是當用ad-PUMA腺病毒感染心肌細胞，獲得過表達PUMA的心肌細胞后，然后進行缺氧后處理，明顯降低缺氧后

9、處理的細胞保護作用，表現(xiàn)為心肌細胞凋亡率和死亡率明顯高于單純的缺氧后處理組（P<0.001）。
　　2.ARC在缺氧后處理心肌保護中作用的研究
　　（1）生理條件下ARC在心肌細胞存活中的作用：分別用antisense-ARC和scramble-ARC轉(zhuǎn)染心肌細胞，發(fā)現(xiàn)：antisense-ARC抑制內(nèi)源性ARC蛋白表達的同時，可以增加心肌細胞凋亡率和死亡率（P<0.05）；而scramble-ARC對內(nèi)源性ARC蛋白表達以

10、及心肌細胞凋亡率和死亡率無明顯影響（P>0.05）。
　　（2）研究ARC是心肌細胞在缺氧/復氧條件下存活的關鍵因子：缺氧/復氧可以明顯下調(diào)ARC的蛋白表達，增加心肌細胞的凋亡率和死亡率（P<0.05）。而用ARC腺病毒感染心肌細胞后，獲得ARC過表達的心肌細胞，然后進行缺氧/復氧處理，心肌細胞的凋亡率和死亡率明顯低于缺氧/復氧組（P<0.05）。但是用b-gal腺病毒感染心肌細胞，再進行缺氧/復氧處理，心肌細胞的凋亡率和死亡率與

11、單純的缺氧/復氧組比較無顯著性差異（P>0.05）。
　?。?）探究ARC在缺氧后處理抑制缺氧/復氧誘導心肌損傷中的作用：缺氧后處理在明顯抑制缺氧/復氧誘導的ARC蛋白表達下調(diào)的同時，可以明顯降低缺氧/復氧誘導的心肌細胞的凋亡率和死亡率增加（P<0.01）。但是用antisense-ARC抑制內(nèi)源性ARC的表達,缺氧后處理對心肌細胞的凋亡率和死亡率的抑制作用明顯降低（P<0.01）。而用scramble-ARC轉(zhuǎn)染細胞后，缺氧后處

12、理對心肌細胞損傷的保護作用無明顯變化（P>0.05）。
　　3.缺氧后處理以PUMA和ARC為靶分子抑制心肌細胞凋亡的途徑研究
　?。?）缺氧后處理以PUMA和ARC為靶分子抑制線粒體膜電位減低：缺氧后處理可以明顯抑制缺氧/復氧誘導的線粒體膜電位下降（P<0.01，與缺氧/復氧組比較）。與此相對照，用adPUMA轉(zhuǎn)染心肌細胞獲得PUMA過表達細胞或者antisense-ARC抑制內(nèi)源性ARC的表達后，再進行缺氧后處理，線粒體

13、膜電位與單純的缺氧后處理組比較差異顯著（P<0.01）。而用b-gal或scramble-ARC轉(zhuǎn)染心肌細胞，再進行缺氧后處理，線粒體膜電位與單純的缺氧后處理組比較無顯著性差異（P>0.05）。
　　（2）缺氧后處理以PUMA和ARC為靶分子抑制細胞色素c釋放和Bax轉(zhuǎn)位：正常對照組Bax表達在胞漿中，細胞色素c表達在線粒體中。在缺氧/復氧條件下，Bax從胞漿轉(zhuǎn)位至線粒體，細胞色素c從線粒體釋放至胞漿。而給予缺氧后處理細胞，Bax

14、在線粒體中的表達和細胞色素c在胞漿中的表達明顯減少。與此相對照，當用adPUMA或antisense-ARC轉(zhuǎn)染心肌細胞，然后研究PUMA基因過表達或者ARC基因被抑制后缺氧后處理對Bax轉(zhuǎn)位和細胞色素c釋放的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：過表達PUMA或者降低內(nèi)源性ARC的表達后可以明顯抑制缺氧后處理對Bax轉(zhuǎn)位和細胞色素c釋放的阻斷作用。
　　研究結(jié)論：
　　1.缺血后處理通過下調(diào)促凋亡因子PUMA的表達，上調(diào)抗凋亡因子ARC的表達，