pH通過(guò)AMPK調(diào)控心肌細(xì)胞自噬的分子機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：酸堿平衡是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，保證細(xì)胞正常代謝與功能的前提，而受諸多因素的影響，機(jī)體pH會(huì)發(fā)生一定的波動(dòng)。pH改變會(huì)引發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列信號(hào)變化，參與多種病理生理過(guò)程的調(diào)控。例如嚴(yán)重?zé)齽?chuàng)傷、嚴(yán)重感染、慢性腎衰及代謝性疾病等發(fā)生后，細(xì)胞產(chǎn)酸大于排酸，導(dǎo)致酸中毒，造成細(xì)胞損傷、組織臟器功能障礙。而胞漿堿化與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，是惡性腫瘤重要特征之一。這提示pH對(duì)細(xì)胞功能狀態(tài)具有重要調(diào)控作用。
　　心臟是循環(huán)系統(tǒng)的動(dòng)力器官，嚴(yán)重?zé)齻?/p>

2、后早期即出現(xiàn)心臟損傷。心臟受損不僅可引起心功能不全，還可進(jìn)一步加重全身其它組織器官缺血缺氧性損害。因此，燒傷后心肌損害的研究具有極其重要的理論與臨床意義。既往研究表明 pH下降在介導(dǎo)心臟損傷中發(fā)揮重要作用，酸中毒可導(dǎo)致心肌興奮-收縮耦聯(lián)障礙，造成心肌收縮力減弱，還可直接損害心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)造成器質(zhì)性損害。但 pH如何引起心肌損傷，其發(fā)生規(guī)律及具體分子機(jī)制仍不完全清楚。
　　自噬是指溶酶體介導(dǎo)的胞漿物質(zhì)被降解循環(huán)再利用的過(guò)程，可更新

3、細(xì)胞內(nèi)衰老、變性或錯(cuò)誤折疊的蛋白，清除多余或受損的細(xì)胞器，以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。既往研究證明，自噬在心肌組織中廣泛存在，涉及到許多心臟疾病的心肌病理學(xué)過(guò)程，對(duì)于穩(wěn)定心臟結(jié)構(gòu)和功能有著重要的作用。例如在缺血性心肌病、心力衰竭、心肌炎及心肌肥厚等疾病過(guò)程中，心肌細(xì)胞的自噬活動(dòng)會(huì)增強(qiáng)。但自噬是否參與調(diào)控了 pH異常引起心肌損傷及發(fā)揮何種作用目前尚不清楚。有研究表明，細(xì)胞外 pH的改變會(huì)影響MCF-10A、MCF-7、Hela等細(xì)胞的自噬活性，

4、Marino等的研究發(fā)現(xiàn)酸性環(huán)境能激活人黑色素瘤細(xì)胞的自噬，從而促進(jìn)細(xì)胞存活，這提示我們pH是影響細(xì)胞自噬重要因素，且具有細(xì)胞特異性。因此推測(cè)：pH是否通過(guò)調(diào)控自噬引起心肌細(xì)胞功能改變。
　　細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)和調(diào)控是一個(gè)非常復(fù)雜而精密的過(guò)程，許多因素均可以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生自噬，如缺氧、營(yíng)養(yǎng)壓力、氧化應(yīng)激壓力均可激活細(xì)胞自噬，同時(shí)又有許多信號(hào)分子參與自噬的調(diào)控，如能量信號(hào)主要通過(guò) AMPK調(diào)控自噬，絲裂原信號(hào)主要通過(guò)mTORC1影響自噬活

5、性，其他的還有 p53、beclin1等信號(hào)通路均可參與自噬的調(diào)控。一磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMPK）是一種進(jìn)化保守的、功能強(qiáng)大的絲/蘇氨酸蛋白激酶，在心臟中，多種損傷如饑餓、缺血缺氧以及氧化應(yīng)激等均可導(dǎo)致AMPK激活。活化的 AMPK在維持細(xì)胞能量代謝和細(xì)胞存活中發(fā)揮重要作用。其中，自噬就是AMPK依賴(lài)的一種重要的適應(yīng)和存活機(jī)制。然而關(guān)于AMPK如何調(diào)控自噬，目前存在不同的說(shuō)法。較早的研究認(rèn)為AMPK活化后能夠通過(guò)抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉

6、素靶點(diǎn)（mTOR）活性激活自噬。隨著對(duì)AMPK功能及作用機(jī)制的研究深入，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn) AMPK可以直接作用于ULK1調(diào)控自噬，而且大量研究證明AMPK-ULK1是誘導(dǎo)自噬的關(guān)鍵。然而在酸、堿處理?xiàng)l件下AMPK調(diào)控心肌細(xì)胞自噬的下游信號(hào)仍不清楚。本課題旨在研究pH對(duì)心肌細(xì)胞自噬活性的影響及其相關(guān)分子機(jī)制，為 pH改變所致的心肌損傷的臨床防治提供新的思路。
　　研究方法
　　1.通過(guò)調(diào)控培養(yǎng)基 pH模擬細(xì)胞外酸、堿化條件，

7、采用 CCK8及 LDH釋放檢測(cè)酸、堿處理?xiàng)l件下心肌細(xì)胞活力的改變。采用蛋白免疫印記（WB）和免疫熒光（IF）檢測(cè)酸、堿處理?xiàng)l件下心肌細(xì)胞自噬活性的變化。然后采用熒光分子探針檢測(cè)酸、堿處理?xiàng)l件下溶酶體酸度的改變，進(jìn)一步用巴佛洛霉素A1（Baf A1）抑制溶酶體酸化后，檢測(cè)酸、堿處理?xiàng)l件下自噬活性的變化。
　　2.首先采用WB檢測(cè)酸、堿處理?xiàng)l件下心肌細(xì)胞 AMPK活性的變化。使用重組腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建了低表達(dá)AMPKα2的心肌細(xì)胞模

8、型。然后干預(yù)AMPK，采用WB和IF檢測(cè)酸、堿處理?xiàng)l件下心肌細(xì)胞自噬水平的變化。此外，采用CCK8、LDH釋放及SYTOX green檢測(cè)酸、堿處理?xiàng)l件下AMPK及其調(diào)控的自噬對(duì)心肌細(xì)胞活力的影響。
　　3.首先采用 WB檢測(cè)酸、堿處理?xiàng)l件下心肌細(xì)胞 mTORC1活性的變化。干預(yù)AMPK，采用WB檢測(cè)酸、堿處理?xiàng)l件下心肌細(xì)胞mTORC1活性的改變。進(jìn)一步干預(yù)mTORC1，檢測(cè)其對(duì)酸、堿處理?xiàng)l件下心肌細(xì)胞AMPK活性及自噬水平的影響

9、。采用WB檢測(cè)了酸、堿處理?xiàng)l件下ULK1活性的改變。干預(yù)AMPK，檢測(cè)酸、堿處理?xiàng)l件下心肌細(xì)胞ULK1活性的變化。建立了低表達(dá)ULK1的心肌細(xì)胞模型。干預(yù)ULK1，采用WB和IF檢測(cè)酸、堿處理?xiàng)l件下心肌細(xì)胞自噬水平的變化。最后采用CCK8、LDH釋放及SYTOX green染色檢測(cè)酸、堿處理?xiàng)l件下ULK1及其調(diào)控的自噬對(duì)心肌細(xì)胞活力的影響。
　　結(jié)果：
　　1.酸化處理3h后，即發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞活力明顯下降，且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)

10、，心肌細(xì)胞損傷加重；堿化處理后早期，細(xì)胞活力增加，持續(xù)堿化作用可導(dǎo)致細(xì)胞活力下降。酸化處理后，LC3-I向LC3II轉(zhuǎn)換減少；堿化處理誘導(dǎo)LC3-I向LC3II轉(zhuǎn)換增多。酸、堿化處理后，與自噬活性負(fù)相關(guān)的 p62蛋白表達(dá)均下降。免疫熒光顯示 LC3和LAMP1共定位良好；溶酶體檢測(cè)結(jié)果提示細(xì)胞外pH改變后6 h，溶酶體的酸度未見(jiàn)明顯下降；采用Baf A1處理后，酸、堿處理?xiàng)l件下心肌細(xì)胞LC3-II蛋白及p62蛋白均顯著積累。
　　

11、2.酸化處理抑制心肌細(xì)胞AMPK活性，堿化處理誘導(dǎo)心肌細(xì)胞AMPK激活。酸化處理6 h后，細(xì)胞自噬水平下降，而使用Met激活A(yù)MPK后細(xì)胞自噬水平升高，使用AMPKα2 shRNA抑制AMPK活性可逆轉(zhuǎn)Met誘導(dǎo)的自噬活性上調(diào)；堿化處理后6 h自噬水平升高，使用AMPKα2 shRNA抑制AMPK活性可顯著阻斷堿化處理誘導(dǎo)的自噬水平上調(diào)。酸化處理6 h后，心肌細(xì)胞活力下降，死細(xì)胞數(shù)目增加，而使用Met激活 AMPK和自噬活性后，酸化處理

12、誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷減輕，死細(xì)胞數(shù)目減少，使用AMPKα2 shRNA抑制AMPK活性可阻斷這一效應(yīng)；堿化處理6 h后，細(xì)胞活力升高，死亡細(xì)胞減少，使用AMPKα2 shRNA抑制AMPK活性后細(xì)胞活力下降，細(xì)胞死亡數(shù)目增多。
　　3.酸化處理下調(diào)心肌細(xì)胞mTORC1活性，堿化處理誘導(dǎo)mTORC1激活。酸、堿處理?xiàng)l件下，使用Met和AMPKα2 shRNA激活/抑制AMPK6 h后，mTORC1活性無(wú)明顯變化。酸、堿處理?xiàng)l件下，使用mE

13、GF/RAPA激活/抑制mTORC16 h后，AMPK活性和自噬水平均無(wú)顯著變化。酸化處理抑制心肌細(xì)胞 ULK1活性，堿化處理誘導(dǎo)ULK1激活。酸化處理6 h后，ULK1活性下降，而使用Met激活A(yù)MPK后細(xì)胞ULK1活性增強(qiáng)，使用AMPKα2 shRNA抑制AMPK活性可逆轉(zhuǎn)Met誘導(dǎo)的ULK1激活；堿化處理上調(diào)ULK1活性，使用AMPKα2 shRNA干擾后可抑制這一效應(yīng)。酸化處理6 h后，自噬水平下降，而使用 Met激活 AMPK

14、和 ULK1后細(xì)胞自噬水平上調(diào)，進(jìn)一步使用ULK1 shRNA抑制ULK1活性可逆轉(zhuǎn)Met誘導(dǎo)的自噬活性增高；堿化處理誘導(dǎo)自噬水平升高，使用ULK1 shRNA敲降ULK1表達(dá)可顯著阻斷這一過(guò)程。酸化處理6 h后，細(xì)胞活力下降，死亡細(xì)胞增加，而使用Met激活A(yù)MPK和自噬活性可減輕酸化誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，進(jìn)一步使用ULK1 shRNA敲降 ULK1表達(dá)可阻斷這一效應(yīng)；堿化處理6 h后，細(xì)胞活力升高，死亡細(xì)胞減少，使用ULK1 shRNA敲降

15、ULK1表達(dá)后細(xì)胞活力下降，細(xì)胞死亡數(shù)目增多。
　　結(jié)論：
　　1.酸化處理導(dǎo)致細(xì)胞損活力下降，堿化處理后早期細(xì)胞活力升高，持續(xù)作用細(xì)胞活力下降。酸化處理后，心肌細(xì)胞自噬活性明顯下降；堿化處理誘導(dǎo)自噬激活，酸、堿化處理后均不伴有自噬通量的損傷。
　　2. pH可調(diào)控心肌細(xì)胞AMPK的活性，AMPK介導(dǎo)了pH對(duì)原代心肌細(xì)胞自噬活性及細(xì)胞活力的調(diào)控。
　　3. pH可調(diào)控心肌細(xì)胞中mTORC1的活性，酸、堿處理?xiàng)l件下

16、，AMPK和mTORC1的相互作用不明顯，mTORC1信號(hào)通路在pH介導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬調(diào)控中不發(fā)揮主要作用。酸、堿處理?xiàng)l件下，ULK1可能是AMPK的重要下游靶標(biāo)之一，AMPK可能通過(guò)調(diào)控ULK1信號(hào)通路介導(dǎo)心肌細(xì)胞自噬活性和細(xì)胞活力的改變。
　　4.酸、堿處理?xiàng)l件下，早期發(fā)生的細(xì)胞自噬均有保護(hù)心肌的作用，抑制自噬活化會(huì)加重心肌細(xì)胞損傷。
　　5.在嚴(yán)重?zé)齻剐菘酥委熤?，如何使血液酸堿度控制在既不影響血紅蛋白釋放氧，又不影響