慢性血栓栓塞性肺動脈高壓的病理生理機制研究及心肺運動試驗的預(yù)測作用.pdf

1、慢性血栓栓塞性肺動脈高壓(Chronicthromboembolic pulmonaryhypertension，CTEPH)在肺動脈高壓分類中屬于第四大類。急性肺血栓栓塞癥(Acute pulmonary thromboembolism，APE)患者5年內(nèi)發(fā)生CTEPH的累積發(fā)病率約為0.4％-5.1％。這一部分患者發(fā)生CTEPH的病理生理機制目前不明確。CTEPH的病理特征為肺動脈內(nèi)不能消融的血栓繼發(fā)纖維化、機化。既往有多項研究顯示

2、:1、鐵代謝紊亂與血栓性疾病密切相關(guān)。2、病理研究顯示CTEPH患者的非阻塞血管的遠端動脈也發(fā)生了與特發(fā)性肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)相同的叢狀病變?；蛲蛔兪翘匕l(fā)性PAH及可遺傳性PAH的重要發(fā)病機制，目前已發(fā)現(xiàn)多個基因突變與PAH發(fā)病有關(guān)，CTEPH患者是否存在PAH相關(guān)的基因突變目前尚不清楚。3、差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究是明確疾病發(fā)病機制、尋找疾病特異的蛋白質(zhì)分子的良好方法。4、及

3、早發(fā)現(xiàn)CTEPH的存在并給予積極治療有望改善患者預(yù)后。因此本課題從鐵代謝、基因突變和蛋白質(zhì)組學(xué)三個方面探討CTEPH可能的發(fā)病機制;并以心肺運動試驗評估APE后不同疾病狀態(tài)患者的表現(xiàn)，以尋找預(yù)測CTEPH的敏感因子。
　　二、研究內(nèi)容
　　第一部分鐵代謝在CTEPH發(fā)病過程中作用的研究
　　1、研究目的:
　　通過比較CTEPH患者和急性PE事件后痊愈的患者鐵代謝情況，明確鐵代謝是否與CTEPH有關(guān)。
　　

4、2、研究方法
　　2.1研究對象:2013年4月至2014年3月在阜外醫(yī)院肺血管病科住院的明確診斷的CTEPH患者和慢性PE患者。
　　2.2實驗室檢測:收集空腹血漿，檢測血漿自由鐵濃度、鐵蛋白、可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(sTfR)、hepcidin-25、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、丙二醛(MDA)水平。
　　2.3統(tǒng)計學(xué)分析:連續(xù)數(shù)據(jù)兩組間比較采用student' s t檢驗或Mann-Whi

5、tney U檢驗;分類變量的兩組間比較采用卡方檢驗。非結(jié)合鐵離子濃度與hepcidin-25、sTfR，鐵蛋白、sTfR/鐵蛋白比值、TNF-α、IL-6、MDA間的相關(guān)關(guān)系采用Spearman相關(guān)系數(shù)表示。 hepcidin-25濃度與上述各檢測指標的關(guān)系采用Spearman相關(guān)系數(shù)表示。Logistic回歸模型分析CTEPH與上述各檢測指標的關(guān)系。
　　3、研究結(jié)果
　　血漿非結(jié)合鐵離子濃度在CTEPH組與慢性PE對照組

6、無明顯差別。兩組間hepcidin-25、sTfR、TNF-α、MDA水平也無顯著差別。CTEPH組的IL-6顯著高于對照組。hepcidin-25水平與sTfR濃度呈負相關(guān)(Spearman's r=-0.438，p＜0.001); hepcidin-25水平與鐵蛋白呈正相關(guān)(Spearman's r=0.503，p＜0.001)。血漿非結(jié)合鐵離子濃度與hepcidin-25、sTfR、鐵蛋白、sTfR/鐵蛋白比值、TNF-α、IL-

7、6、MDA均無顯著相關(guān)(見表i-3).單變量logistic回歸分析顯示，非結(jié)合鐵離子濃度、sTfR、鐵蛋白、sTfR/鐵蛋白比值、TNF-α、IL-6、MDA均與CTEPH發(fā)病無明顯關(guān)系。
　　4、第一部分研究結(jié)論
　　鐵代謝水平與CTEPH發(fā)病無明確相關(guān)。CTEPH患者和慢性PE患者的機體sTfR水平及鐵蛋白水平均在正常范圍。
　　第二部分 CTEPH患者的基因突變研究
　　1、研究目的
　　通過比較C

8、TEPH患者和有PE病史而無PAH的患者的基因變異情況，目的是明確PAH相關(guān)的基因突變是否參與了CTEPH的發(fā)病。
　　2、研究方法
　　2.1研究對象:49名CTEPH患者和17名有PE病史而無PH的對照組患者。
　　2.2基因突變檢測:收集血液標本，提取全基因組DNA。直接測序并與參考序列比對檢測PAH相關(guān)的基因:BMPR2、ACVRL1、ENG、SMAD9、CAV1、KCNK3、CBLN2。多重連接探針擴增(ML

9、PA)方法檢測片段重排突變。點突變對基因功能的影響以PolyPhen-2軟件進行預(yù)測。
　　2.3兩組間的基因突變頻率比較采用Fisher's檢驗。采用卡方檢驗明確基因型分布是否服從Hardy-Weinberg平衡定律。
　　3、研究結(jié)果
　　共66個樣本進行了基因變異的分析，包括49名CTEPH患者及17名PE后無PAH的患者。CBLN2的CDS1因技術(shù)原因PCR擴增失敗。共發(fā)現(xiàn)40個基因突變位點，包括31個點突變和

10、9個片段重排。13個位點很可能造成功能破壞，2個突變位點可能造成破壞，2個突變位點為良性突變。3名研究對象有多處的點突變。CTEPH患者的PAH相關(guān)基因的非同義突變比率大于對照組(CTEPH組25/49(51％) vs.對照組3/17(18％)，p=0.022)。共發(fā)現(xiàn)12個在dbSNP數(shù)據(jù)庫中已有記錄的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)。比較了兩組間的基因型及等位基因頻率后，發(fā)現(xiàn)SN

11、P rs3739817和SNP rs55805125與CTEPH有關(guān)。
　　4、第二部分研究結(jié)論
　　中國漢族CTEPH患者中較高的PAH致病基因的突變頻率可能與CTEPH發(fā)病有關(guān)。
　　第三部分 CTEPH患者的蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　1、研究目的
　　從CTEPH患者的肺動脈內(nèi)膜切除組織中進行差異蛋白質(zhì)對比，以尋求發(fā)病過程中的“特異蛋白質(zhì)分子”或“特異的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路”。
　　2、研究方法
　　2

12、.1實驗分組:1）CTEPH患者行肺動脈血栓內(nèi)膜切除術(shù)中取得的增生內(nèi)膜組織提取蛋白質(zhì)的等份混合物;2）培養(yǎng)的人肺動脈內(nèi)皮細胞、人肺動脈平滑肌細胞、人肺成纖維細胞，收集并鑒定后提取蛋白質(zhì)的等份混合物。
　　2.2兩組蛋白質(zhì)混合物以高效液相色譜(high-performance liquid chromatography，HPLC)分離后作色質(zhì)聯(lián)用進一步分離、鑒定。
　　2.3兩次均分離鑒定到的蛋白質(zhì)在兩組間比較，取得病變組織特

13、異表達的蛋白質(zhì)譜作進一步的GO和KEGG生物信息學(xué)分析。
　　3、研究結(jié)果
　　組織特異性的蛋白質(zhì)為679個。由特異表達蛋白質(zhì)的生物學(xué)過程富集結(jié)果顯示，特異表達蛋白質(zhì)主要參與了損傷反應(yīng)、免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、補體激活及血液凝固等生物過程。特異表達蛋白質(zhì)主要構(gòu)成細胞外基質(zhì)、血小板、分泌顆粒、脂蛋白復(fù)合體以及囊泡等細胞組分。特異表達蛋白質(zhì)主要發(fā)揮了與糖類結(jié)合、酶抑制劑激活以及與鈣離子結(jié)合等功能。富集于補體及凝血通路、系統(tǒng)性紅斑狼瘡

14、通路、ECM與受體結(jié)合通路、細胞粘附分子通路、Fc epsilon RI信號通路、白細胞跨內(nèi)皮遷移通路、朊病毒疾病通路（CCL5，補體C1qa，C1QB，C1QC，C6，C7，C8A，C8B，C8G）、病毒性心肌炎、Fc gamma R介導(dǎo)的胞吞通路等信號通路。
　　4、第三部分研究結(jié)論
　　此部分CTEPH患者肺動脈血栓內(nèi)膜的蛋白質(zhì)組學(xué)研究得到679個病變組織特異的蛋白質(zhì)。特異表達蛋白質(zhì)主要參與了損傷反應(yīng)、免疫反應(yīng)、炎癥反

15、應(yīng)、補體激活及血液凝固等生物過程。富集于補體及凝血通路、系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)?、ECM與受體結(jié)合通路、細胞粘附分子通路、Fc epsilon RI信號通路、白細胞跨內(nèi)皮遷移通路等信號通路。
　　第四部分心肺運動試驗在預(yù)測CTEPH中的作用
　　1、研究目的
　　在這部分研究中，我們評估了APE存活者三種不同的預(yù)后狀態(tài)，以期發(fā)現(xiàn)敏感的心肺運動試驗的疾病監(jiān)測指標。
　　2、研究方法
　　2.1研究對象:自2011年

16、1月至2014年5月間連續(xù)入選符合標準的，在我科住院的66名CTEPH患者、44名慢性PE患者、15名PE痊愈患者。慢性PE、PE痊愈患者以及3例CTEPH來自2011年1月起始的中國肺栓塞注冊登記研究(2011BA11B17)。36名健康成年人作為對照組。
　　2.2心肺運動試驗:在醫(yī)生監(jiān)督下進行癥狀限制的功率遞增式直立踏車運動試驗。先進行3分鐘靜息數(shù)據(jù)采集后開始3分鐘的無負荷踏車運動，繼之3分鐘的持續(xù)功率遞增直至最大耐受量。氣

17、體交換采用逐次呼吸測量系統(tǒng);功率遞增幅度的選擇根據(jù)對患者病史包括日常運動量和運動強度、體格檢查和肺功能狀況綜合決定。遞增
　　方案:CTEPH組、CPE組為10～15 W/min，對照組為10～30 W/min。
　　2.3統(tǒng)計分析:連續(xù)數(shù)據(jù)組間比較采用方差分析;分類變量的組間比較采用卡方檢驗。Pearson或Spearman相關(guān)分析臨床數(shù)據(jù)與VE/VC02斜率、VD/VTphy、最低點VE/VC02比值。多變量線性回歸分析

18、明確CPET中的獨立預(yù)測CTEPH的指標。受試者工作曲線(receiver operator characteristic curve，ROC)分析預(yù)測效力。以ROC曲線的最佳截點分類待測數(shù)據(jù)，應(yīng)用單變量和多變量logistic回歸分析建立預(yù)測模型。
　　3、研究結(jié)果
　　CTEPH患者的最低點VE/VC02比值比慢性PE組和PE痊愈組明顯增高(43.4 L/minvs29.9 L/min vs27.1L/min, p＜0.

19、005); VE/VC02斜率(48.4 L/min/L/min vs29.9L/min/L/min vs28.0 L/min/L/min，p＜0.005)及攝氧效率平臺(OUEP)(37.1 L/minvs27.0 L/min vs25.2 L/min，p＜0.005)也顯著高于慢性PE組和PE痊愈組。Logistic回歸分析顯示，最低點VE/VC02比值≥34.35 L/min是預(yù)測CTEPH的最強因子(OR159.0，95％ CI

20、36.0-702.3，p＜0.001)。慢性PE組的最低點VE/VC02比值較對照組高(29.9 L/min vs26.5 L/min，p＜0.05)，但最低點VE/VC02比值在痊愈組和對照組無差別。在多元線性回歸分析中，基于肺通氣/灌注顯像評價的血管阻塞率(PVO)是慢性PE組和痊愈組的通氣效率指標的獨立預(yù)測因子。
　　4、第四部分研究結(jié)論
　　4.1CTEPH患者的通氣效率降低;
　　4.2最低點VE/VC02比

21、值是預(yù)測CTEPH的最佳指標;
　　4.3通氣效率隨急性PE恢復(fù)而改善。
　　三、結(jié)論
　　1、鐵代謝水平與CTEPH發(fā)病無明確相關(guān)。CTEPH患者和慢性肺栓塞患者的機體sTfR水平及鐵蛋白水平均在正常范圍。
　　2、中國漢族CTEPH患者中較高的PAH致病基因的突變頻率可能與CTEPH發(fā)病有關(guān)。
　　3、CTEPH患者肺動脈血栓內(nèi)膜切除的組織特異表達蛋白質(zhì)主要參與了損傷反應(yīng)、免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、補體激活及