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文檔簡介
1、目的:觀察高脂對糖尿病(DM)大鼠β細胞功能的影響及其機制,并探討胰島素治療的作用。 方法:采用小劑量鏈脲佐菌素(STZ,25mg/kg體重)和高脂飲食誘導(dǎo)的方法建立DM大鼠模型。DM大鼠隨機分為3組:DM高脂飲食(DH)組、DM正常飲食(DN)組和DM高脂飲食及胰島素治療(DHI)組;正常Wistar大鼠為正常對照(NC)組。DH組及DHI組大鼠給予高脂喂養(yǎng),DN組和NC組大鼠給予正常飲食,同時DHI組大鼠給予胰島素治療。10
2、周后,行口服葡萄糖耐量試驗(OGTT),測定血糖和血胰島素值,并根據(jù)血糖和血胰島素值計算糖負荷后胰島素增值與血糖增值的比值(△I30/△G30)和修正的β細胞胰島素分泌指數(shù)(MBCI)。取胰腺:胰頭部分做石蠟切片,胰尾部分液氮保存。SABC方法定位β細胞內(nèi)的胰島素,半定量分析胰島素蛋白的表達,并測定相對β細胞數(shù)量和平均β細胞面積。RT-PCR技術(shù)半定量分析胰島素、絲氨酸軟脂酰轉(zhuǎn)移酶(SPT)及Caspase-3基因表達。酸乙醇方法抽提胰
3、腺內(nèi)胰島素并測定。免疫熒光雙標(biāo)記和免疫印跡法測定β細胞內(nèi)的增殖細胞核抗原(PCNA)蛋白表達。免疫熒光雙標(biāo)記法測定Bcl-2蛋白表達。碘化丙啶(PI)法測定β細胞的凋亡。同時測定血和胰腺內(nèi)的FFA和TG。 結(jié)果:與NC組相比,DH組和DN組的血和胰腺內(nèi)的FFA和TG增加,胰島素蛋白及基因表達和胰島素含量下降;葡萄糖刺激的胰島素分泌曲線低平;△I30/△G30和MBCI下降,其中以DH組更明顯(P<0.05)。 與NC組相
4、比,DN組和DH組的相對β細胞數(shù)量和平均β細胞面積減少;β細胞的凋亡、SPT和Caspase-3基因表達水平均升高,而Bcl-2和PCNA的蛋白表達降低,且以DH組的改變最顯著(P<0.05~P<0.01)。 與DH組相比,DHI組大鼠經(jīng)過胰島素治療后,血FFA和TG水平雖然沒有明顯改善,但是胰腺內(nèi)的TG、FFA明顯降低。同時胰島素基因及蛋白表達和胰島素含量增加;胰島素分泌功能、△I30/△G30和MBCI改善;相對β細胞數(shù)量和
5、平均β細胞面積增加;β細胞凋亡、SPT和Caspase-3基因的表達水平均降低;Bcl-2和PCNA的表達改善(P<0.05~P<0.01)。 結(jié)論:長期高脂可促使小劑量STZ和高脂飲食誘導(dǎo)的DM大鼠胰島素分泌功能障礙,且β細胞分泌功能障礙與胰島素基因和蛋白表達下降致β細胞內(nèi)的胰島素含量降低及β細胞增殖降低,凋亡增加致β細胞數(shù)量減少有關(guān)。胰島素治療對高脂所致的上述作用有保護作用,這種保護作用部分和胰腺內(nèi)FFA及TG沉積改善相關(guān)。
6、 第一部分DM大鼠模型的建立及其代謝特點的研究 目的:觀察小劑量STZ和高脂飲食誘導(dǎo)的DM大鼠的血糖、血脂(FFA和TG)、血胰島素、胰島素敏感性指數(shù)(ISI)和胰島素抵抗指數(shù)的特點。 方法:雄性Wistar大鼠隨機分為NC組和模型組。模型組大鼠給予STZ(25mg/kg體重)腹腔注射,NC組大鼠給予相應(yīng)劑量的檸檬酸緩沖液。2w后行OGTT,糖耐量異常者給予高脂飲食。NC組大鼠仍給予正常飲食。模型組大鼠飼以高脂飲
7、食8w后行OGTT,測定血糖,確定DM大鼠模型有無建立。測定DM大鼠血游離脂肪酸(FFA)、血甘油三酯(TG)、血膽固醇(Chol)及血胰島素,并根據(jù)血糖和血胰島素值計算ISI和胰島素抵抗指數(shù)。 結(jié)果:DM組大鼠0min、30min、60min和120min的血糖分別為NC組大鼠對應(yīng)時點血糖的1.5倍、1.4倍、1.5倍和1.6倍,且差異均具有顯著性(P<0.01);同時血FFA、TG和Chol也明顯增加,分別為NC組的1.9倍
8、(P<0.01)、1.4倍(P<0.01)和1.6倍(P<0.01)。DM組大鼠空腹胰島素為NC組大鼠的1.2倍(P<0.05),并且ISI下降,胰島素抵抗指數(shù)增加,與NC組相比,差異具有顯著性(P<0.01、P<0.01)。 結(jié)論:用小劑量STZ和高脂飲食誘導(dǎo)的DM大鼠具備高血糖、脂代謝紊亂、胰島素抵抗(IR)和高胰島素血癥的特點。 第二部分高脂對DM大鼠胰島素基因和蛋白表達、胰島素含量及胰島素分泌功能的影響
9、目的:觀察高脂對DM大鼠β細胞胰島素基因和蛋白表達、胰島素含量和胰島素分泌功能的影響。 方法:DM大鼠隨機分為2組:DH組和DN組;正常Wistar大鼠為NC組。DH組大鼠繼續(xù)高脂喂養(yǎng),DN組大鼠正常飼料喂養(yǎng)。10周后,三組大鼠行OGTT,測定0min、30min、60min和120min的血糖和胰島素值。并根據(jù)血糖和血胰島素值計算△I30/△G30和MBCI。取胰腺:胰頭部分做石蠟切片,胰尾部分液氮保存。SABC方法定位β細胞
10、內(nèi)的胰島素,并半定量分析胰島素蛋白的表達。RT-PCR技術(shù)半定量分析胰島素基因表達,酸乙醇方法抽提胰腺內(nèi)胰島素并測定。同時測定血和胰腺內(nèi)的FFA和TG。 結(jié)果:與NC組相比,DH組和DN組的血和胰腺內(nèi)的FFA和TG增加,葡萄糖刺激的胰島素分泌曲線低平,△I30/△G30和MBCI顯著下降,以DH組為著,差異均具有顯著性(P<0.05~P<0.01)。DN組和DH組胰島素蛋白和基因表達及胰島素含量均明顯低于NC組,其中以DH組降低
11、更明顯(P<0.05)。 結(jié)論:長期高脂可損傷DM大鼠胰島素基因和蛋白的表達,同時細胞內(nèi)的胰島素含量降低,β細胞胰島素分泌功能顯著下降。且高脂導(dǎo)致的上述改變可能和胰腺內(nèi)的脂質(zhì)沉積有關(guān)。 第三部分高脂對DM大鼠β細胞數(shù)量的影響及β細胞凋亡可能的影響因素 目的:觀察高脂對DM大鼠β細胞增殖、β細胞凋亡及β細胞數(shù)量的影響及凋亡的相關(guān)因素。 方法:SABC法定位NC組、DN組和DH組大鼠β細胞內(nèi)的胰島素后,測定平
12、均β細胞面積和相對B細胞數(shù)量;免疫熒光雙標(biāo)記和免疫印跡法測定β細胞內(nèi)的PCNA蛋白表達;免疫熒光雙標(biāo)記法測定Bcl-2蛋白表達;PI法測定β細胞的凋亡;并應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測凋亡相關(guān)蛋白絲氨酸軟脂酰轉(zhuǎn)移酶(SPT)和Caspase-3的基因表達。 結(jié)果:DN組和DH組的相對β細胞數(shù)量和平均β細胞面積均較NC組減少(P<0.05~P<0.01),且以DH組的改變顯著(P<0.05)。DN組的β細胞的凋亡率、SPT和Caspas
13、e-3基因表達水平較NC組升高,而Bcl-2和PCNA的蛋白表達較NC組下降(P<0.05)。DH組的β細胞凋亡、SPT和Caspase-3基因表達的升高和Bcl-2及PCNA蛋白表達的下降則進一步加劇(vsDN組,P<0.05~P<0.01)。 結(jié)論:高脂可導(dǎo)致DM大鼠β細胞數(shù)量減少,這種數(shù)量減少是由于β細胞凋亡增加,增殖能力降低所致。β細胞凋亡可能系SPT和Caspase-3表達增加,Bcl-2表達下降所致。 第四部
14、分胰島素治療對高脂導(dǎo)致的DM大鼠β細胞功能障礙的作用及機制 目的:胰島素治療對高脂導(dǎo)致的DM大鼠β細胞功能障礙的作用及可能的機制。方法:DM大鼠隨機分為3組:DH組、DN組和DHI組,及NC組。DH組和DHI組大鼠高脂喂養(yǎng),DN組和NC組大鼠給予正常飲食,DHI組大鼠同時給予胰島素治療。胰島素治療10周后,行OGTT及取胰腺組織,測定指標(biāo)同第二、第三部分。 結(jié)果:與DH組相比,DHI組大鼠經(jīng)過胰島素治療后,血FFA和TG
15、水平雖然沒有明顯改善,但是胰腺內(nèi)的TG、FFA明顯降低。胰島素基因及蛋白表達和胰島素含量增加,分別為DH組的4.41倍(P<0.01)、2.11(P<0.01)倍和1.47倍(P<0.05);胰島素分泌功能較DH組有所恢復(fù),△I30/△G30和MBCI高于DH組(P<0.05~P<0.01)。同時相對β細胞數(shù)量和平均β細胞面積較DH組得以改善(P<0.01、P<0.05);β細胞凋亡、SPT和Caspase-3基因的表達、Bcl-2和P
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