五甲基槲皮素改善糖尿病大鼠認(rèn)知功能障礙的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:
　　糖尿病是由于胰島素抵抗或者胰島素分泌不足所致的以高血糖為特征的代謝性疾病,可以引起多種并發(fā)癥。糖尿病腦病是糖尿病最復(fù)雜的慢性并發(fā)癥之一,臨床上以認(rèn)知功能障礙為主要表現(xiàn),輕者學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降﹑空間定向困難,重者可發(fā)展為癡呆。迄今為止,其確切的病理?yè)p傷機(jī)制依然是迷霧重重,給糖尿病腦病的防治帶來(lái)很大的困難。因此,深入研究糖尿病腦病的發(fā)生機(jī)制和防治措施,對(duì)提高糖尿病腦病患者生存質(zhì)量具有重要意義。
　　cAMP反應(yīng)

2、元件結(jié)合蛋白(CREB)是一種真核生物細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控因子,激活CREB可以增加突觸可塑性蛋白、記憶相關(guān)蛋白的表達(dá)及新的突觸生成,在神經(jīng)元再生、突觸形成及學(xué)習(xí)記憶等方面具有重要的調(diào)節(jié)作用。Akt/CREB是CREB激活通路中的一種。由于糖尿病狀態(tài)下,胰島素信號(hào)通路活性下降,首要影響下游的Akt的信號(hào)通路。因此很自然想到,糖尿病誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙可能是由于海馬神經(jīng)元Akt的活性下降,使得CREB的磷酸化減少,影響多種與記憶有關(guān)的靶基因轉(zhuǎn)錄,最

3、終導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能障礙。因此,改善Akt/CREB信號(hào)通路的活性可能成為治療糖尿病腦病有效靶點(diǎn)。
　　多甲氧基黃酮(PMFs)是一類富含甲氧基的酚類化合物,廣泛的存在自然界中?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)PMFs具有廣泛的藥理作用,如改善胰島素抵抗,抗炎,抗氧化,改善認(rèn)知功能障礙,可作為防治糖尿病誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙的候選藥物。五甲基槲皮素(PMQ)是典型的多甲氧基黃酮類化合物,從結(jié)構(gòu)式上可以推斷也應(yīng)該有上述功能。然而迄今為止,有關(guān)PMQ改善糖尿病

4、誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙的研究還未見(jiàn)報(bào)道。
　　有鑒于此,本課題通過(guò)采用自發(fā)性2型糖尿病GK大鼠和新生鼠STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型,研究認(rèn)知功能、海馬神經(jīng)元樹突棘形態(tài)學(xué)及Akt/CREB信號(hào)通路在糖尿病大鼠中的改變,探討Akt/CREB信號(hào)通路在糖尿病所致的海馬神經(jīng)元損傷和學(xué)習(xí)記憶功能障礙中的作用。同時(shí),本課題也通過(guò)PMQ治療自發(fā)性2型糖尿病GK大鼠,干預(yù)高糖誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元損傷,探討PMQ保護(hù)糖尿病誘導(dǎo)的腦損傷的機(jī)制。
　　研究

5、方法:
　　1、選擇雄性新出生2天后的乳鼠,腹腔注射STZ(90mg/kg),對(duì)照組給以等體積生理鹽水注射,在4周齡時(shí),按空腹血糖隨機(jī)分為對(duì)照組(SD組)和STZ處理組(STZ組),每組12只,連續(xù)喂養(yǎng)29周。12周齡雄性GK大鼠,12只,12周齡雄性Wistar大鼠,9只,常規(guī)飼料喂養(yǎng)20周。大鼠自由進(jìn)食飲水,每天常規(guī)觀察兩次,每周定時(shí)稱量大鼠體重,每天稱量水食消耗,于32周齡做水迷宮實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)后檢測(cè)大鼠空腹血糖,血清胰島素水平

6、,計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)。取大鼠海馬組織,一部分做尼氏染色、高爾基染色及免疫組化等形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)。一部分做Western blot實(shí)驗(yàn)分析Akt、CREB、SYP和BDNF蛋白表達(dá)。
　　2、GK大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)約4周后,按照空腹血糖隨機(jī)分成:GK正常飼料組(GK組,n=12),GK+含PMQ飼料給藥組(PMQ2.5、5、10mg/kg,n=8),GK+含二甲雙胍飼料300mg/kg/d(MET組,n=12),以及Wist

7、ar正常飼料組(Wistar組,n=9)共6組,GK組和Wistar組的大鼠給予正常飼料喂養(yǎng),其它組的大鼠分別給予相應(yīng)含藥飼料。記錄每周大鼠的飲食、飲水及體重。于給藥后第16周進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試。水迷宮實(shí)驗(yàn)后檢測(cè)OGTT、大鼠空腹血糖、血清胰島素水平,計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR);取大鼠海馬組織,一部分做尼氏染色、高爾基染色及免疫組化等形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)。一部分做Western blot分析Akt、CREB、SYP和GluR1蛋

8、白表達(dá)。
　　3、成熟的神經(jīng)元細(xì)胞加入不同濃度的葡萄糖(50、75、100、125mM)分別誘導(dǎo)24、48、72和96小時(shí)后。每孔加入20μlMTT工作液,孵育4h后,棄去各孔培養(yǎng)基,每孔加入200μlDMSO溶解。酶標(biāo)儀570nm檢測(cè)各孔吸光度值。選擇誘導(dǎo)72小時(shí)使海馬神經(jīng)元活力下降到50％左右的葡萄糖濃度,作為最佳葡萄糖濃度和最佳作用時(shí)間,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組如下:正培養(yǎng)液組,甘露醇組,最佳高糖組,最佳高糖+溶劑組,最佳高糖

9、+PMQ(0.1、0.3、1、3、10μM)組,最佳高糖+PMQ(1μM)+LY294002(50μM)組。培養(yǎng)72小時(shí)后,MTT檢測(cè)細(xì)胞活力,Western blot分析Akt、CREB、SYP和GluR1蛋白表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.與正常Wistar和SD大鼠相比,32周齡的GK和STZ大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的高血糖、高胰島素血癥和高胰島素抵抗指數(shù),并伴有體重獲得減少和水食消耗增加,同時(shí)在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中,GK和S

10、TZ大鼠潛逃時(shí)間顯著地延長(zhǎng),在目標(biāo)象限逗留的時(shí)間百分比明顯縮短。而且胰島素抵抗指數(shù)越高,潛逃時(shí)間越長(zhǎng)。在可見(jiàn)目標(biāo)平臺(tái)的實(shí)驗(yàn)中,GK和STZ大鼠潛逃時(shí)間無(wú)顯著性改變,而且,游泳速度沒(méi)有差異性。
　　GK和STZ大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列稀疏,細(xì)胞形態(tài)模糊,正常形態(tài)細(xì)胞明顯減少,細(xì)胞活力顯著降低,樹突棘的密度也顯著減少,長(zhǎng)度變化不明顯。而且GK和STZ大鼠海馬神經(jīng)元活力及樹突棘密度與血糖濃度成負(fù)相關(guān)。同時(shí),GK和STZ大鼠海馬神經(jīng)

11、元p-Akt(Ser473)、p-CREB(Ser133)、SYP和BDNF蛋白的表達(dá)均出現(xiàn)顯著下調(diào),總的Akt和CREB蛋白表達(dá)無(wú)明顯改變。
　　2.PMQ能夠改善GK大鼠食水?dāng)z取指數(shù),降低餐后血糖,降低空腹胰島素水平。同時(shí),PMQ也能改善葡萄糖耐量受損,提高胰島素的敏感性,且呈一定的劑量依賴性,與GK組比較,具有顯著性差異。
　　PMQ干預(yù)能夠顯著縮短潛逃時(shí)間和游泳距離,同時(shí)增加在目標(biāo)現(xiàn)象停留時(shí)間的百分比例,呈現(xiàn)一定的劑

12、量依賴性,PMQ10mg/kg作用尤為明顯。而且胰島素抵抗指數(shù)越小,潛逃時(shí)間越短。
　　PMQ干預(yù)后GK大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列緊密,細(xì)胞形態(tài)清晰,正常形態(tài)細(xì)胞明顯增多,細(xì)胞活力顯著增加,樹突棘的密度也顯著增加。同時(shí)上調(diào)P-Akt、P-CREB、SYP和GluR1的蛋白表達(dá)。
　　3.海馬神經(jīng)元細(xì)胞成熟后,在24h之內(nèi)不同濃度的高糖處理,對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞活力及數(shù)量無(wú)顯著影響,處理48h,50mM和75mM高糖組細(xì)胞活力下降

13、,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,100mM和125mM的高糖組細(xì)胞活力下降出現(xiàn)顯著性差異,處理72h,100mM的高糖使細(xì)胞活力下降到58.8%。而100mM的甘露醇處理對(duì)細(xì)胞活力無(wú)明顯影響。
　　PMQ干預(yù)高糖處理海馬神經(jīng)元后,神經(jīng)元細(xì)胞活力和數(shù)量增加,呈現(xiàn)劑量依賴性,PMQ1μM時(shí),作用達(dá)到平臺(tái),增加濃度,作用不再增加。LY294002干預(yù)后,可部分抵消PMQ的保護(hù)作用。同時(shí),PMQ可以增加海馬神經(jīng)元p-Akt、p-CREB、SYP和Glu

14、R1蛋白的表達(dá),但對(duì)Akt和CREB總的蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響,LY294002干預(yù)后,p-Akt、p-CREB、SYP和GluR1蛋白的表達(dá)上調(diào)不明顯,部分抵消了PMQ的作用。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
　　1.糖尿病大鼠出現(xiàn)了認(rèn)知功能障礙、海馬神經(jīng)元損傷及樹突棘密度減少,其程度與胰島素抵抗呈正相關(guān)。
　　2.海馬神經(jīng)元細(xì)胞存活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路Akt/CREB活性降低在糖尿病認(rèn)知功能障礙中起關(guān)鍵作用。
　　3.PMQ能夠改善糖尿