幾丁寡糖對脂肪酸代謝紊亂的抑制作用及分子機制研究.pdf

1、目的：
　　探討幾丁寡糖（Chitin oLigosaccharide，NACOS）對機體脂代謝紊亂的抑制作用及其潛在的分子機制。
　　方法：
　　體外細胞學實驗：
　?。?）MTT法篩選用藥濃度：分別采用濃度梯度的PA(0、25、50、100和200μM)預先作用24 h，MTT法用酶標儀檢測HepG2細胞增殖的OD值，計算細胞存活率，判斷最適PA濃度。將HepG2細胞經NACOS（0、50、100μg/mL）

2、預處理12 h后，加入PA處理24 h，MTT法檢測細胞存活率，判斷最適NACOS濃度。
　　（2）油紅O染色法：HepG2細胞經NACOS（0、50、100μg/mL）預處理12 h后，再用PA刺激24 h。倒置顯微鏡觀察HepG2細胞形態(tài)學，以此評價NACOS對PA誘導所致的 HepG2細胞中脂質沉淀的影響以及NACOSA抑制HepG2細胞活化的最適濃度。
　?。?）實時熒光定量PCR（Quantitative ReaL

3、-time PCR）檢測HepG2細胞經PA刺激不同時間后過氧化物酶體增殖體受體共激活因子-1α（PGC1α）、炎癥因子IL-1β、乙酰輔酶A1（ACC1）、細胞色素氧化酶亞單位-5b（Cox5b）、中鏈酰基輔酶A脫氧酶（Mcad）的轉錄表達水平，以評價PA對HepG2細胞的最適處理時間；將HepG2細胞經NACOS（100μg/mL）預處理12 h后，加入PA處理24 h，檢測過 PGC1α、IL-1β、ACC1、Cox5b、Mcad

4、的轉錄表達水平，以評價NACOS對PA誘導HepG2細胞脂代謝紊亂的抑制作用。
　?。?）免疫印跡法（Western bLot）檢測HepG2細胞經PA不同時間刺激后MAPKs及PI3K/Akt通路中相關蛋白激酶 p-p38、ERK1/2、Akt的蛋白磷酸化水平的變化，以評價PA對HepG2細胞的最適處理時間；將HepG2細胞經NACOS（0、50、100μg/mL）預處理12 h后，再用PA刺激0.5 h，檢測MAPKs及PI3

5、K/Akt通路中相關蛋白激酶p-p38、p-ERK1/2、p-Akt的蛋白水平的變化，以評價NACOS對PA誘導HepG2細胞脂代謝紊亂的抑制作用。體內實驗雄性C57BL/6小鼠隨機分為4組（n=5），即正常對照（normaL controL group，NCD）組、高脂飲食（high fat diet，HFD）組、NACOS組、NACOS+HFD組，造模20周，乙醚麻醉殺死小鼠，提取肝臟組織進行檢查，用于制備組織勻漿。
　　主要

6、檢測方法如下：
　?。?）考察高脂模型C57BL/6小鼠在給予NACOS后各項生理指標的的變化，如體重、飲水、飲食上的變化。
　?。?）RT-PCR方法檢測肝臟組織中過氧化物酶體增殖體受體共激活因子-1α、白介素因子1-β、乙酰輔酶A1、細胞色素氧化酶亞單位-5b、中鏈?；o酶A脫氧酶的轉錄表達水平的變化。
　?。?）Western bLotting方法檢測MAPKs及PI3K/Akt通路中相關蛋白激酶p-p38、p-

7、ERK1/2、p-Akt的蛋白水平的變化。
　　結果：
　　體外細胞學實驗：
　　（1）MTT細胞活性實驗表明，PA在25-200μM范圍內對HepG2細胞的活力沒有明顯的抑制作用，表明PA在該濃度下沒有細胞毒性，可在此濃度以下進行體外藥效學實驗；NACOS100μg/mL可略微增加HepG2的活力，但沒有統(tǒng)計學差異，且NACOS與PA聯(lián)合進行藥物處理時亦沒有表現(xiàn)出細胞毒作用。
　?。?）油紅 O染色實驗顯示，P

8、A處理后則細胞漿中的紅色脂肪顆粒呈顯著聚集趨勢。與PA單相比，NACOS預處理可明顯抑制PA誘導所致的HepG2細胞中脂滴的形成。
　?。?）RT-PCR實驗結果表明，HepG2細胞經PA100μM處理3-24h后，PGC1α、IL-1β、ACC1、Cox5b、Mcad均表現(xiàn)出不同程度的升高（P<0.05或0.01），并在作用6 h后達峰值。
　　（4）Western bLotting結果顯示，HepG2細胞經PA100μM

9、刺激后，絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen activated protein kinases，MAPKs）及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（Phosphoinositide3-kinase，PI3K；Protein kinase B，Akt）通路中的p38、ERK1/2、Akt激酶迅速激活，其磷酸化水平在0-1 h內呈時間依賴性增加。其中，p-ERK1/2及p-Akt在0.5 h時達峰值（P<0.05，vs對照組），而p-p38則在1

10、 h時達最高水平（P<0.01，vs對照組）。
　　體內實驗結果表明：
　?。?）與給予基礎飼料的正常對照組（NCD）小鼠比較，高脂模型組（HFD）小鼠的平均體重顯著增加（P<0.01）。相反，當高脂小鼠同時給予NACOS（1 mg/mL）處理時，可顯著抑制其體重的增加（P<0.05或0.01）。高脂飼料和或NACOS均對小鼠的采食量及飲水量沒有明顯影響。
　?。?）RT-PCR實驗結果表明，HFD組小鼠較NCD組小鼠

11、肝臟組織中PGC1α、ACC1及Mcad顯著升高（P<0.05或0.01），炎癥因子IL-1β亦增加明顯（P<0.05），但HFD處理對Cox5b的轉錄表達無顯著影響。與HFD組比較，小鼠經NACOS處理后，其肝臟組織中脂代謝調控因子PGC1α、Mcad及ACC1的轉錄水平均不同程度地得到抑制（P<0.05或0.01），炎癥因子IL-1β亦顯著降低（P<0.05或0.01），Cox5b轉錄表達水平變化不明顯。
　?。?）Weste

12、rn bLotting結果顯示，與NCD組小鼠相比，HFD組小鼠肝臟的p-p38、p-Akt蛋白的表達水平顯著增高（P<0.05），而p-ERK1/2則無明顯差別。與HFD組相比，MACOS可顯著抑制高脂飲食喂養(yǎng)所致p-p38及p-Akt的激活（P<0.01或0.05）。此外，NACOS亦可降低p-ERK1/2的蛋白表達水平（P<0.05）。
　　結論：
　?。?）體外細胞學實驗結果表明：NACOS與PA聯(lián)合進行藥物處理時沒

13、有表現(xiàn)出細胞毒作用NACOS預處理明顯抑制PA誘導所致的HepG2細胞中脂滴的形成；NACOS抑制PA刺激引起的 HepG2細胞脂代謝的紊亂及相關炎癥因子的過表達；NACOS預處理顯著抑制p-p38、p-ERK1/2及p-Akt的表達水平。
　?。?）體內實驗結果表明：高脂小鼠同時給予NACOS（1 mg/mL）處理時，可顯著抑制小鼠體重的增加，高脂飼料和或NACOS對小鼠的采食量及飲水量沒有明顯影響；NACOS處理可有效逆轉高脂