速效胰島素原基因的克隆及其在畢赤酵母中的分泌表達.pdf

1、作為最重要的降血糖藥物，胰島素具有巨大的市場需求。近年來，各國學者紛紛研究各種重組胰島素在醫(yī)療上的應用。重組人胰島素基因曾先后在大腸桿菌和釀酒酵母(S. cerevisiae)中表達，但由于大腸桿菌和釀酒酵母自身的缺陷，表達量受到限制。畢赤酵母(Pichia pastoris)是近年發(fā)展起來的真核表達系統(tǒng)，由于其表達量高，具有翻譯后對成熟蛋白修飾等優(yōu)點而日益受到人們的重視。本研究的目的是克隆B9Asp小C肽人胰島素原基因并通過基因工程技

2、術構建具有高效分泌胰島素能力的畢赤酵母工程菌株。
　　 本研究選用巴斯德畢赤酵母GS115菌株為受體菌，分泌型質粒pPIC9k為載體，構建重組質粒pPIC9k-B9Asp ins，經SacI線性化后，電擊法轉化巴斯德畢赤酵母。用MD選擇培養(yǎng)基初篩出整合型His+Mut+菌株，再利用重組菌對G418抗性的差異篩選和PCR復篩，得到了18株具有較高外源基因拷貝數的重組菌株。經過誘導培養(yǎng)，分別利用Tricine-SDS-PAGE、胰島

3、素放免試劑盒對酵母培養(yǎng)物中的蛋白進行測定，證明外源基因成功分泌表達。進一步研究了其表達模式，發(fā)現(xiàn)隨著誘導時間的延長，重組人胰島素前體表達量也隨之增加，86小時達高峰。優(yōu)化發(fā)酵條件后，再次用胰島素放免試劑盒檢測，證明重組人胰島素具有與胰島素標樣相同的抗體結合能力，在100ml發(fā)酵液中表達量可達到1.9mg/L。
　　 結果表明所設計的人胰島素前體基因在畢赤酵母中獲得了正確的表達，表達的人胰島素前體可以被正確的加工和折疊。這為進一步